產蛋白酶菌株的篩選及以菜籽粕為氮源的產酶條件優化

陳 蘢，楊 俊，馬毛毛，吳莎莎，余 平,3，曾哲靈,3,*

（1.南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；3.南昌大學資源環境與化工學院，江西 南昌 330031）

蛋白酶是水解蛋白質氨基酸基團之間的肽鍵的酶，是構成重要的工業酶類之一。目前，工業酶的全球銷售額估計為42億 美元[1-2]，而蛋白水解酶約占60%。蛋白酶常用于洗滌劑、食品蛋白質、釀造、肉類、皮革和乳制品行業[3-6]，為提高營養價值、消化率、適口性、風味和減少變應原性化合物，處理生活垃圾和工業廢物，以及參與蛋白質的合成和結構解析作出了重要貢獻[7]。蛋白酶廣泛存在于各種微生物、動物和植物中[8]，由于微生物具有快速生長、生長所需的空間小以及易于遺傳操作等經濟和技術優勢，是目前工業蛋白酶的主要來源。一些產蛋白酶的微生物陸續被發現，如真菌類中的霉菌及酵母菌[9-11]等，細菌中的枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）[12]，鹽單胞菌屬（Halomonas）[13]等。近年來，世界各地對蛋白酶的需求呈現上升的趨勢，人們愈發關注高產蛋白酶菌株的研究[14]。鄧維琴等[15]從豆瓣醬中篩選出17 株高產蛋白酶菌株。王慶齡[16]從南極磷蝦中篩選出低溫下高產蛋白酶菌株。如何獲得新的高產蛋白酶菌株，越來越成為當前研究的熱點。

蛋白酶生產原料成本約占總成本的40%。傳統方法一般以豆粕作為發酵原料以生產蛋白酶，但是隨著養殖業的快速發展，大量豆粕被用作飼料，無法滿足酶工業需求，因此，尋找價格低廉、營養價值高的蛋白酶原料迫在眉睫[17]。我國油菜籽產量居世界首位，占全球油菜籽產量的21.14%[18-19]，菜籽粕作為這種油料作物的低廉廢料，其蛋白質含量較高，為干物質的33.9%～36%，因此，具有作為發酵原料產蛋白酶的潛力。此外，蛋白酶的微生物合成受到多種因素的影響，例如溫度、pH值、碳源、氮源、發酵時間和發酵類型[20]，其中碳源和氮源的類型及其濃度的合理使用對酶生產成本的降低起到至關重要的作用。因此，優化工藝條件是酶生產過程中非常必要的一步。

本實驗從食堂污水中篩選出1 株高產蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌CL-10，將其作為出發菌，以菜籽粕作為發酵的氮源，以單因素試驗和響應面法優化培養基組成，以期為蛋白酶生產成本的降低和菜籽粕的資源化利用提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

樣品來源：南昌大學食堂污水。

酪氨酸標準樣品、福林-酚、脫脂奶粉 北京索萊寶生物科技有限公司；DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；干酪素 天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術有限責任公司；菜籽粕、花生粕、豆粕、芝麻粕 南昌市農貿市場；MgSO4、CaCl2、NaCl2、葡萄糖、硫酸銨、表面活性劑、無水碳酸鈉等無機鹽離子 西隴科學股份有限公司。所有試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

初篩培養基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，脫脂牛奶1.5%，脫脂牛奶單獨滅菌在110 ℃滅菌15 min；LB培養基（種子培養基）：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1%；基礎發酵培養基：豆粕4%，玉米粉3%，麩皮3%，KH2PO40.03%，Na2HPO4g 12H2O 0.4%，pH值為自然。以上培養基在121 ℃滅菌鍋滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UZWY-2102C恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ST 16R低溫高速離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；XSZ-4G型中級生物顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；JSM 6701F型場發射掃描電鏡帶能譜儀 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 發酵培養

參考肖彥駿等[21]關于培養解淀粉芽孢桿菌培養的方法并適當修改。用接種環取斜面保存的菌株2 環，接入裝有25 mL LB培養基的錐形瓶中，200 r/min、37 ℃培養12 h進行活化作為種子液。將活化好的菌液按4%的接種量接入裝有50 mL發酵培養基的錐形瓶中，200 r/min、37 ℃培養48 h，10 000 r/min離心取上清發酵液，測定蛋白酶活力。

1.3.2 菌種篩選

初篩：取食堂污水樣品用梯度稀釋法稀釋適當倍數，將稀釋的樣品涂布于初篩培養基平板上，平板在37 ℃培養24 h。用接種環挑取有明顯水解圈的菌株劃線挑取單菌落，用游標卡尺測量水解圈和菌落直徑，選取水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株作為初篩的產蛋白酶菌株。

復篩：將初篩篩選的比值較大的菌株接種于基礎發酵培養基中，37 ℃發酵48 h后離心取上清液，測定發酵液中蛋白酶活力，選取酶活力最高的菌株命名為CL-10。

1.3.3 菌株的鑒定

參照文獻[22]通過菌株形態觀察、掃描電鏡、各種生理生化實驗和16S rRNA測序鑒定產生蛋白酶的菌株。使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，參照權淑靜等[23]的方法擴增菌株16S rDNA，將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物測序。通過GenBank數據做相似性分析，使用MEGA7.0軟件構建系統發育樹。

1.3.4 蛋白酶活力測定和平均氮源成本

按照GB/T 23527ü 2009《蛋白酶制劑》[24]，采用福林-酚法測定中性蛋白酶活力。酶活力單位定義：1 mL液體酶在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，即為一個酶活力單位，以U/mL表示。

平均氮源成本=氮源消耗質量×氮源單價/單位酶活力×發酵總體積；菜籽粕單價=0.66豆粕單價=0.49花生粕單價=0.58芝麻粕單價。

1.3.5 單因素試驗確定發酵培養基成分

1.3.5.1 氮源種類和含量對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

將基礎發酵培養基中的豆粕分別用4%的菜籽粕、花生粕、芝麻粕、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨替換，進行發酵培養，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳氮源種類。將選擇出的氮源質量分數分別設為3%、4%、5%、6%、7%、8%，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳氮源含量。

1.3.5.2 碳源種類和含量對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

在上述優化的基礎上，將基礎發酵培養基中的葡萄糖分別用3%麥芽糖、甘油、淀粉、葡萄糖、乳糖、糊精、玉米粉替換，進行發酵培養，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳碳源種類。將選擇出的碳源質量分數分別設為1%、2%、3%、4%、5%、6%，以發酵液上清中蛋白酶活力為指標，確定最佳碳源含量。

1.3.5.3 麩皮質量分數對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

在上述優化的基礎上，將基礎發酵培養基中的麩皮質量分數設為1%、2%、3%、4%、5%、6%，進行發酵培養，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳麩皮質量分數。

1.3.5.4 表面活性劑種類和體積分數對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

在上述優化的基礎上添加表面活性劑進行發酵培養，表面活性劑分別為體積分數0.4%的吐溫20、吐溫60、吐溫80、曲拉通X-100，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳表面活性劑種類。將選擇出的表面活性劑體積分數分別設為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳表面活性劑濃度。

1.3.5.5 金屬離子種類和質量分數對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

在上述優化的基礎上添加金屬離子進行發酵培養，金屬離子分別為質量分數0.1%的Fe2(SO4)3、MgSO4、ZnSO4g 7H2O、CaCl2、CuSO4、MnCl2g 4H2O、Al(NO3)3g 9H2O，以發酵液上清中蛋白酶活力為指標，確定最佳金屬離子種類。將選擇出的金屬離子鹽質量分數分別設為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%，以發酵上清液中蛋白酶活力為指標，確定最佳金屬離子質量分數。

1.3.6 發酵培養基響應面試驗優化

以單因素試驗結果為基礎，確定對發酵產蛋白酶最具影響的3 個因素菜籽粕質量分數（A）、玉米粉質量分數（B）、麩皮質量分數（C），以蛋白酶活力（Y）作為響應值，采用Design-Expert 10.0.1軟件，應用Box-Behnken方法設計試驗組合，優化和驗證產酶最佳發酵條件，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

經過初篩和復篩，篩選出1 株基礎產蛋白酶活力為2 715 U/mL的菌株，并命名為CL-10，參照文獻[22]，對菌株CL-10進行生理生化鑒定實驗。如圖1所示，該菌株水解圈與菌落直徑比較大，菌體呈短桿狀。由表2可知，菌株CL-10為芽孢桿菌屬。由圖2可知，菌株CL-10與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）MPA1034在同一分支，序列相似性為100%。綜合菌株的形態特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系統進化樹的結果，可以將分離菌株CL-10鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 菌株CL-10蛋白酶水解圈形態（A）和掃描電鏡形態（B）Fig.1 Proteolytic circles (A) formed by strain CL-10 and scanning electron microscope morphology (B)

表2 菌株生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification of the strain

圖2 菌株CL-10 16S rDNA序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CL-10 based on 16S rDNA sequence

2.2 發酵培養基成分的確定

2.2.1 氮源對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

從圖3a可知，不同氮源對產酶影響有較大差異，有機氮源比無機氮源更有利于發酵產酶。其中，以成本最低的菜籽粕作為氮源時，酶活力最大，達到3 891.5 U/mL，與以豆粕作為氮源的基礎發酵培養基相比，酶活力提高了43.3%，平均氮源成本低。菜籽粕中蛋氨酸和賴氨酸等氨基酸成分的含量較高[25]，鈣、磷、硒、錳礦物質含量高，這些氨基酸和礦物質對解淀粉芽孢桿菌的生長和產酶有明顯的促進作用，這可能是菜籽粕作為氮源大大促進解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的原因。進一步優化得菜籽粕質量分數為6%時（圖3b），蛋白酶活力最高為4 339.7 U/mL，因此選擇6%的菜籽粕作為優化發酵培養基氮源。

圖3 氮源種類（a）和菜籽粕質量分數（b）對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen source (a) and rapeseed meal (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

2.2.2 碳源對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

圖4 碳源種類（a）和玉米粉質量分數（b）對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.4 Effects of carbon source (a) and corn flour (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

從圖4a可以看出，當玉米粉作為碳源時蛋白酶活力最高，其余依次為葡萄糖、糊精、淀粉、甘油、乳糖、麥芽糖，這可能是因為玉米粉中含有多種微生物需要的營養成分，能促進蛋白酶的生成。當玉米粉質量分數為4%時有最高酶活力4 409 U/mL（圖4b）。解淀粉芽孢桿菌產酶需要足夠的碳源，濃度較低導致微生物營養不充分，影響生長代謝，進而影響產酶，但玉米粉濃度過高培養基較黏稠，不利于代謝進而抑制產酶。因此選擇4%的玉米粉粕作為優化發酵培養基碳源。

2.2.3 麩皮質量分數對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

圖5 麩皮質量分數對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.5 Effect of wheat bran on protease production by B.amyloliquefaciens

麩皮中含有較多的維生素及微量元素，在微生物發酵過程中常被用作生長因子添加到發酵培養基中。由圖5可知，在1%～3%之間，隨著麩皮質量分數的增加，酶活力逐漸增加，在3%達到產酶最大值4 422.4 U/mL，大于3%酶活力逐漸減少。因此選擇優化發酵培養基的麩皮質量分數為3%。

2.2.4 表面活性劑對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

圖6 表面活性劑（a）和吐溫20體積分數（b）對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.6 Effects of surfactant type (a) and Tween 20 (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

由圖6a可知，表面活性劑吐溫80、吐溫60對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶有輕微的抑制效果，曲拉通的抑制效果最明顯，相反，表面活性劑吐溫20對發酵產蛋白酶有促進效果。相對于對照組，添加吐溫20酶活力提高了6.8%，是因為吐溫20作為一種非離子型表面活性劑，可以增大細胞膜的滲透性，減少酶在細胞膜上的吸附量，細胞內的酶更容易透過細胞膜而分泌出來[26-27]。在吐溫20體積分數為0.7%時達到最大值5 156.7 U/mL（圖6b），因此選擇優化發酵培養基中表面活性劑為吐溫20且體積分數為0.7%。

2.2.5 金屬離子對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響

圖7 金屬離子種類（a）和ZnSO4g 7H2O質量分數（b）對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.7 Effects of metal ions (a) and ZnSO4·7H2O concentration (b) on protease production by B.amyloliquefaciens

研究發現，添加少量的金屬離子對蛋白酶活性有顯著提高[28]。由圖7a可知，對酶活力影響最大的是ZnSO4g 7H2O，提高了10.2%，這是因為部分中性蛋白酶活性部位不含Zn2+，額外加入的Zn2+能通過疏水鍵結合、金屬結合和離子相互作用等方式提高中性蛋白酶的熱穩定性[29]。因此，出于發酵培養基簡單原則，選擇添加ZnSO4g 7H2O。ZnSO4g 7H2O質量分數在0.2%達到最大值5 841.3 U/mL（圖7b），隨著ZnSO4g 7H2O質量分數增加，酶活力逐漸降低，這是因為離子濃度過高對微生物產酶產生抑制作用。因此選擇添加ZnSO4g 7H2O且質量分數為0.2%。

2.3 響應面設計結果與分析

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗

以菜籽粕質量分數（A）、玉米粉質量分數（B）、麩皮質量分數（C）為響應面試驗的3 個因素，以蛋白酶活力（Y）為響應值，通過3因素3水平的Box-Behnken試驗設計和響應面分析方法，確定解淀粉芽孢桿菌發酵菜籽粕產蛋白酶最佳工藝條件，結果見表3。應用Design-Expert 10.0.1軟件進行多元回歸擬合分析，各試驗因素對響應值的綜合影響可用如下多元二次回歸方程表示：Y=6 409.58+88.18A+140.90B+237.33C-37.85AB-2.50AC-252.20BC-290.82A2-113.87B2-354.31C2。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Box-Behnken design and experimental results for response surface analysis

表4 響應面分析試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

如表4所示，整體模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.106 7），說明該回歸方程可真實反映自變量和因變量的關系，模型中的R2為97.8%，調整后為95%，說明95%的響應值變化可以通過模型進行解釋，因此可以用此模型進行分析和預測。

2.3.2 各因素交互作用分析

圖8 各因素交互作用對解淀粉芽孢桿菌產蛋白酶的影響Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of rapeseed meal, corn flour and wheat bran levels on protease production by B.amyloliquefaciens

由圖8可以看出，蛋白酶活力隨著菜籽粕質量分數、玉米粉質量分數、麩皮質量分數的變化出現先升高后降低的趨勢，其中BC交互作用為極顯著，AB和AC為不顯著。通過優化得到解淀粉芽孢桿菌發酵產蛋白酶的最佳工藝參數為菜籽粕質量分數6.125%、玉米粉質量分數4.375%、麩皮質量分數3.199%，該條件下的蛋白酶活力預測值為6 465.4 U/mL。根據實際稱量的方便將工藝參數調整菜籽粕質量分數6.1%、玉米粉質量分數4.4%、麩皮質量分數3.2%，在此條件下進行3 組平行驗證實驗，得到蛋白酶活力平均值為6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。實際值與預測值有很好的擬合性，進而驗證了模型的有效性。相比較于耿芳等[30]從土壤中篩選的產蛋白酶活力1 932.3 U/mL的黏質沙雷氏菌，Zeng Cheng等[31]篩選的產酶為4 536.5 U/mL的解淀粉芽孢桿菌，游玟娟等[32]篩選的產酶2 665.2 U/mL的枯草芽孢桿菌，本實驗篩選的菌株優勢明顯。此外，溫擁軍等[33]和于新穎[34]同樣通過發酵菜籽粕產蛋白酶，結果分別為2 602.7 U/mL和1 959.82 U/mL，亦低于本研究的結果。因此，本研究篩選的菌株和發酵條件，可高效生產蛋白酶。

3 結 論

本研究篩選出1 株高產蛋白酶的菌株，通過形態學觀察，生理生化實驗和16S rDNA測序鑒定為解淀粉芽孢桿菌CL-10。以此為出發菌，通過單因素試驗和響應面優化培養基成分，探究出最佳發酵培養基條件為：菜籽粕質量分數6.1%、玉米粉質量分數4.4%、麩皮質量分數3.2%、ZnSO4g 7H2O質量分數0.2%、吐溫20體積分數0.7%。相較于基礎培養基，在最優條件下，酶活力從2 715 U/mL提高到6 385.1 U/mL，平均氮源成本降低了54.6%。本實驗用解淀粉芽孢桿菌發酵菜籽粕產蛋白酶，具有酶活力高、成本低、工藝簡單的特點，可以作為蛋白酶工藝優化和菜籽粕的資源化利用的方法。但是現階段該菌的酶活相對于工業化生產的菌株還有距離，期待后期通過進一步優化及誘變得到可以進行工業化生產的菌株。