乳酸鈣對高酯柑橘果膠乳化性的影響

范傳會，何建軍，陳學玲，王少華

（湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430068）

果膠是從植物組織中提取、總半乳糖醛酸含量大于65%的天然生物大分子多糖[1]。根據酯化度不同，果膠分為高酯果膠（酯化度大于50%）和低酯果膠（酯化度小于50%）[2]。果膠具有促進腸道有益菌生長、降膽固醇、降血糖和抗癌等多種生理功能[3-5]。GB 2760ü 2014《食品添加劑使用標準》[6]規定果膠作為綠色、安全、無毒的增稠劑、穩定劑及乳化劑，在除果蔬汁以外的多種食品中可根據實際生產情況適當添加，不作添加量上限限制。果膠廣泛存在于植物組織中，從柑橘屬植物中提取的果膠稱為柑橘果膠。中國是柑橘主產區之一，據統計2018年中國柑橘產量為4 138.1萬 t[7]。柑橘汁是柑橘加工產品之一，在柑橘汁加工過程中約50%～60%柑橘果實轉變為廢棄物，不僅造成資源的大量浪費，還會對環境造成污染[8]。柑橘汁加工廢棄物中含有豐富的果膠，以柑橘廢棄物為原料提取果膠并加以利用，既充分利用了柑橘汁加工廢棄物，又減少了廢棄物對環境造成的污染，有利于柑橘加工業的綠色、健康發展。

乳化性質是果膠最重要的性能指標之一，關于果膠乳化性質的研究已經展開多年。一般認為影響果膠乳化性質的因素主要分為兩部分，一是內在因素（例如甲基化程度、蛋白質殘留量、乙酰基和分子質量等），二是外在因素（例如果膠濃度、蛋白質含量、pH值和離子強度等）[9-11]。果膠分子中含有疏水基團和親水基團，兩親物質果膠溶于水后會發生自主裝，聚集形成膠束（果膠的聚集體）。已有報道表明果膠溶于水后，因氫鍵的作用迫使果膠分子形成果膠簇[12]。文獻[13]中的原子力顯微鏡圖片也探測到了果膠聚集態的存在。目前研究果膠乳化性時，通常從果膠分子的疏水基團、親水基團和分子柔性等[14-15]方面分析其乳化性質，忽略了果膠自組裝后形成的膠束對其乳化性質的影響。根據兩親分子性質，果膠在水溶液中形成膠束后，果膠分子的親水性基團會分布在膠束的外表面。當單獨用果膠作為乳化劑時，果膠膠束因外表面分布著大量的親水基團，果膠膠束對其乳化性影響較少。果膠膠束的外表面含有的親水基團中包括未甲酯化的羧基，未甲酯化的羧基帶有負電性，電解質中含有帶正電的陽離子（如鈣離子），向果膠溶液中加入電解質（如乳酸鈣），因靜電作用電解質會改變果膠膠束性質，果膠膠束對其乳化性的影響則需要進一步研究。目前關于果膠膠束對其乳化性影響的研究鮮有報道。

本研究用商品高酯柑橘果膠（high methoxy citrus pectin，HMP）為乳化劑，以果膠膠束性為切入口，分析外加電解質乳酸鈣對HMP膠束形態和大小等變化，探討乳酸鈣對HMP乳化性質的影響，旨在為改善HMP乳化性質提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H M P（酯化度（7 1.2 f 2.2）%，重均相對分子質量（138f 2）×103，半乳糖醛酸含量≥74.0%（干質量）） Sigma（中國）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

雷磁PHS-3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；POLYPON PT.MR 2100均質器 上海斯高勒生物科技有限公司；Jeol 2010透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會社；Ultrascan 4000數碼相機 美國Gatan公司；Mastersizer PAP2000粒度儀、Zetasizer Nanoseries Nano ZS粒度儀 英國馬爾文公司；Leica DM3000顯微鏡 徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司；DP-26數碼顯微照相裝置 奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠樣品溶解

前期研究發現只有當HMP濃度大于一定值時，乳酸鈣才能顯著改善HMP的乳化能力。為了具體說明乳酸鈣濃度對HMP乳化性的影響，本實驗固定HMP濃度，通過改變乳酸鈣濃度，分析乳酸鈣濃度對HMP乳化能力的影響。HMP溶液的配制方法如下：將HMP溶解在0.04%疊氮化鈉（抗菌劑，防止微生物生長）的溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌24 h，配制成質量分數1.80%的果膠溶液，備用。

1.3.2 混合液的制備

用蒸餾水配制濃度為0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mmol/L乳酸鈣溶液。取5.00 mL 1.80%高酯果膠溶液分別于5.00 mL不同濃度的乳酸鈣溶液混合制備成含有0.90% HMP和0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00 mmol/L乳酸鈣的混合溶液，將混合溶液用均質器13 000 r/min均質2 min后備用。

1.3.3 果膠膠束大小測定

將上述混合溶液用蒸餾水稀釋30 倍后，采用動態光散射法，用Zetasizer Nanoseries Nano ZS粒度儀測定HMP膠束大小。

1.3.4 HMP膠束TEM觀察

用TEM觀察HMP膠束在水和乳酸鈣溶液中的形態。在觀察之前，先對HMP膠束樣品染色。具體步驟如下：取1 滴樣品滴加在涂有碳的銅柵格漂浮2.00 min。用鑷子除去格柵，并用濾紙芯吸掉多余的樣品。在超純水中短暫沖洗后，如前所述，將多余樣品用濾紙芯吸走，將格柵放在1.00%的乙酸雙氧鈾滴上1 min。用濾紙濾去多余的污漬，將格柵風干。將樣品染色后，在120 kV電壓下用連接有Digital Micrograph軟件的Jeol 2010透射電子顯微鏡和Gatan Ultrascan 4000數碼相機獲得TEM圖像。

1.3.5 乳液的制備

以上述混合液為水相，以用堿性氧化鋁過濾后的菜籽油為油相，以7∶3的水油質量比將水相和油相加在內徑1.60 cm、高8.50 cm的玻璃瓶內，用均質器以13 000 r/min速率均質2.00 min，制備乳液。

1.3.6 乳化性分析[9]

將乳液室溫下放置28 d，以乳化指數為指標，分析乳化劑的乳化性質。

式中：乳液高度為乳化層高度+水層高度。

1.3.7 乳滴形態觀察

在載玻片上加入1 滴乳液并加上蓋玻片，在白光下用顯微鏡觀察自然狀態下乳滴的形態和大小。取乳化層溶液3.00 g加入2 滴質量分數為0.05%的剛果紅溶液染色過夜，將染色后的乳液滴加在載玻片上，加上蓋玻片；將蒸餾水滴加在載玻片的一端，另一端用吸水紙輕輕吸出水分，洗滌乳滴3 次；高倍鏡下觀察乳滴形態。

1.3.8 乳液粒度測定

設定水相相對折光為1.34，油相相對折光系數為1.46，以蒸餾水作為分散劑，用激光粒度儀測定新鮮乳液的粒度，結果以d（0.9）表示。

1.4 數據分析

實驗數據為3 次實驗的平均值，并用Excel 2013軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸鈣濃度對HMP膠束粒度分布和形態的影響

圖1 乳酸鈣濃度對HMP膠束大小分布的影響Fig.1 Effects of calcium lactate concentrations on the size distribution of HMP micelles

兩親分子在水中溶解時，其親油基團總傾向于脫離極性的水環境；當水溶液中兩親分子達到一定濃度時，其在水溶液中自發地形成以親水基團朝向水環境、親油基團處于內部的聚集體，該過程被稱為自組裝；自組裝形成的聚集體被稱為膠束[16]。HMP分子中含有多種疏水基團（甲酯化羧基、酰胺基和阿魏酰基等）和親水基團（未甲酯化羧基和氫鍵等）。理論推測果膠在水溶液中溶解時，同樣會發生自主裝形成膠束，該推測也得到了文獻[13]中原子力顯微鏡觀察結果的證實。因此圖1結果可認為是HMP膠束在溶液中的粒度分布圖。由圖1a可知，HMP溶解在純水中，形成的膠束顆粒大小分布在341～2 818 nm之間，膠束顆粒分布呈單峰分布，說明膠束大小不均勻。由圖1b～f可知，乳酸鈣濃度影響HMP膠束粒度分布，隨著乳酸鈣濃度的增加，HMP膠束的粒度分布向著變大的方向移動；當乳酸鈣濃度增加到7.50 mmol/L時，果膠膠束開始呈現多峰分布狀態，且主峰粒度分布范圍在400～3 000 nm之間，呈增大趨勢。果膠中的未甲酯化羧基可與鈣離子發生交聯反應，交聯反應的模型被稱為“雞蛋型”模型[17]。HMP果膠僅在鈣離子存在的條件下不能形成凝膠[18]，因此本實驗中HMP溶液加入乳酸鈣后沒有形成凝膠。根據膠束性質知，當果膠達到一定濃度時，果膠膠束才會出現[19]。圖1中HMP顆粒主峰分布向增大的方向移動及多峰分布的出現，可能是因為乳酸鈣中鈣離子的作用；其中70～200 nm分布的顆粒可能是溶液中的HMP分子通過鈣離子的交聯作用形成的小顆粒，3 000～7 000 nm分布的顆粒可能是HMP膠束彼此之間通過鈣離子的交聯形成的大顆粒。

圖2 0.90% HMP膠束在水溶液（a）和在12.50 mmol/L乳酸鈣溶液（b）中的TEM圖Fig.2 TEM Images of 0.90% HMP micelle in water (a) and in 12.50 mmol/L calcium lactate solution (b)

由圖2a可知，HMP膠束在水溶液中呈現多種形態且大小不均勻，如桿狀、圓弧狀和不規則圓球狀等；膠束顆粒之間單獨存在，不存在網狀交聯結構。類似圓球狀HMP膠束在文獻[20]中也有報道。對比圖1a可知，TEM觀察到的HMP膠束在水溶液的大小略小于動態光散射下測定的HMP膠束大小。其原因是圖1測定的膠束大小是在水溶液狀態下的大小，HMP因為溶脹作用變大[21-22]；而TEM觀察的膠束大小是在干燥狀態下的大小，故HMP膠束大小略微減少，HMP膠束形態在乳酸鈣溶液中顯著不同于其在水溶液中的形態。如圖2b所示，在乳酸鈣溶液中HMP膠束彼此連接在一起形成了網狀結構，膠束表面出現細小的毛發狀結構，其原因是乳酸鈣改變HMP膠束在溶液中結構。圖2b中箭頭所指將膠束彼此連接在一起的細小絲線結構可能是與鈣離子交聯后的HMP分子。類似結構在文獻[23]中也有出現。

2.2 乳酸鈣對HMP的乳化能力和乳液穩定性的影響

圖3 HMP和乳酸鈣混合液制備的乳液圖Fig.3 Photographs of emulsion prepared from HMP with added calcium lactate

由圖3可知，乳液在室溫下放置28 d后，當水相中乳酸鈣的濃度不大于10.00 mmol/L時，乳液出現了乳析現象，乳液上層沒有油析出說明乳滴沒有發生顯著聚合。由圖4可知，當乳酸鈣濃度由2.50 mmol/L增大至12.50 mmol/L時，乳液的乳化指數由0.47增加到1.00，說明乳酸鈣顯著提升了HMP乳化能力。類似作用結果在文獻[24]中也有報道，但其中所用果膠為低酯柑橘果膠（low methoxy citrus pectin，LMP）。LMP分子中未甲酯化羧基含量高于HMP分子中未甲酯化羧基含量[2]，根據膠束形成理論[16]推測LMP在水溶液中形成的膠束大小與HMP在水溶液中形成的膠束大小不同；LMP膠束外表面分布的未甲酯化羧基含量大于HMP膠束外表面分布的未甲酯化羧基含量。但文獻[25]顯示鈣離子會降低果膠的乳化能力，產生相反結果的原因可能是果膠種類和鈣鹽種類不同。果膠來源和理化性質會影響果膠的乳化性質[26]。文獻[27]選擇阿拉伯膠進行實驗，阿拉伯膠的主要單糖組分為阿拉伯糖和半乳糖，與果膠的主要單糖組分（半乳糖醛酸）不同，使阿拉伯膠在水溶液中的存在形式不同，因此，阿拉伯膠在鈣離子條件下，乳化性變化與本實驗結果不同。

圖4 乳酸鈣濃度對乳液乳化指數的影響Fig.4 Effect of calcium lactate concentration on creaming index (CI) of emulsion

2.3 乳滴大小和分布

圖5 乳酸鈣對乳滴d（0.9）值的影響Fig.5 Effect of calcium lactate concentration on emulsion droplet d (0.9)

由圖5可知，加入乳酸鈣后，乳滴d（0.9）值變小，但在2.5～12.5 mmol/L范圍內，d（0.9）變化不顯著，說明在該濃度范圍內，增加乳酸鈣濃度不能顯著改變乳液的乳滴大小。如圖6a所示，單獨用HMP作為乳化劑制備乳液時，乳滴大小呈雙峰形式分布，其中乳滴大小的主峰分布在10.00～100.00 μm，次峰分布在1.00～10.00 μm。圖6說明乳液中乳滴大小不均勻，乳液為多分散乳液。由圖6b～f知，當乳酸鈣濃度高于5.00 mmol/L時，乳滴分布中的次峰消失，乳滴分布呈現單峰分布；而乳酸鈣對乳滴的主峰分布范圍無顯著影響，但對峰型有影響，加入乳酸鈣乳滴峰型更加纖細，說明乳酸鈣使乳滴的大小分布向在10.00～100.00 μm的范圍內向中部集中；該種乳滴大小分布的峰型改變是降低d（0.9）值的原因。

圖6 HMP和乳酸鈣混合物制備的乳液乳滴大小分布圖Fig.6 Droplet size distribution of emulsion prepared from HMP with added calcium lactate

2.4 乳滴形態

圖7 HMP和乳酸鈣混合物制備的乳液乳滴形態圖Fig.7 Droplet morphology of emulsion prepared from HMP with added calcium lactate

如圖7所示，乳滴形態為圓球形，大小不均勻，乳液為多分散乳液。仔細觀察乳滴形態，發現部分乳滴為非規則圓球形，且在加入乳酸鈣的乳液中更為明顯，說明乳酸鈣影響乳液中的乳滴形態，可能是因為果膠形成的微凝膠顆粒的作用[28]。剛果紅可以將果膠染成紅色[29]，用剛果紅溶液對乳液進行染色，得到染色后的乳滴形態圖如圖8所示。單獨使用HMP作為乳化劑制備乳液時（圖8a），染色后乳滴的表面比較光滑，不存在染色后的條狀結構；部分乳滴表面的圓形顆粒可能是因為蓋玻片壓下的小粒度乳滴。圖8b是用含有乳酸鈣的HMP制備的乳液，染色后的乳滴表面出現紫紅色細絲條紋，說明乳滴表面附著有物質。結合本實驗所用的乳化劑推測在HMP中加入乳酸鈣，乳滴表面附著的物質為HMP膠束；圖7中非規則圓球形乳滴形態的出現與乳滴表面附著物有關。

圖8 HMP和乳酸鈣混合物制備乳液的乳滴染色形態圖Fig.8 Dyed droplet morphology of emulsion prepared from HMP with added calcium lactate

2.5 乳酸鈣促進HMP乳化能力及促進乳液穩定假設性機理模型

圖9 乳酸鈣促進HMP穩定性的機理模型圖Fig.9 Schematic model illustrating the mechanism for calcium lactate to improve the stability of emulsion prepared with 0.90% HMP

上述分析知乳酸鈣顯著提升HMP的乳化指數，改善HMP乳化性。用含有乳酸鈣的0.9% HMP作為乳化劑制備乳液，乳酸鈣在2.50～12.50 mmol/L濃度范圍內可顯著增加HMP的乳化指數。當乳酸鈣濃度達到12.50 mmol/L時，室溫貯藏28 d，HMP制備的乳液的乳化指數為1.00，無乳析現象出現，說明乳酸鈣可顯著抑制乳析現象的發生。乳酸鈣在2.50～12.50 mmol/L濃度范圍內，乳滴大小分布范圍無顯著變化，說明在該范圍內乳酸鈣對乳滴大小無顯著影響。乳析現象的出現是因為重力的作用[30]。乳酸鈣抑制乳析現象的出現，對乳滴大小無顯著影響，說明將乳酸鈣加入到HMP溶液中，形成的乳滴質量顯著增加。HMP作為乳液劑，主要是因為HMP分子中疏水基團和親水基團的作用。當單獨用HMP作為乳化劑時，果膠膠束因為其表面分布大量的親水基團不能大量吸附在油滴的表面，可能存在微量小粒徑的膠束因為氫鍵的作用而附著油滴表面，但微量膠束不能顯著增加乳滴質量，故HMP膠束對乳液的乳化能力影響較小。在HMP溶液中加入乳酸鈣，乳酸鈣中含有帶正電的金屬陽離子（鈣離子），HMP膠束表面含有帶負電性的未酯化羧基，因靜電作用乳酸鈣會使溶液中HMP膠束性質發生改變。結合本實驗中HMP溶液和乳液的分析結果作出如下假設并繪制出加入乳酸鈣后的HMP乳化機理模型圖（圖9），在鈣離子的作用下，HMP膠束表面分布的未甲酯化羧基與HMP分子之間的未酯化羧基通過鈣離子的交聯作用連接在一起，與HMP分子交聯的HMP膠束，因HMP分子中疏水基團的牽引而附著在油滴表面，附著在油滴表面的HMP膠束之間同樣因鈣離子的交聯作用彼此連接，因此在乳液的油滴表面形成了一層HMP膠束吸附層，顯著增加乳滴質量，有效抑制了乳析現象的發生。在果膠溶液中加入乳酸鈣后，乳液的乳化機理可能發生了改變，形成的乳液類似Pickering乳液。

3 結 論

HMP在水溶液中通過自組裝形成膠束。HMP膠束在水溶液中形狀和大小不均勻，膠束顆粒之間單獨存在，不存在網狀結構。HMP膠束在乳酸鈣中彼此之間通過鈣離子的交聯作用連接形成網狀結構。膠束表面出現細小毛發狀結構。

乳酸鈣顯著提高HMP的乳化性，乳酸鈣可顯著抑制乳液中乳析現象的出現。在HMP加入乳酸鈣，乳液的乳化指數隨著乳酸鈣濃度的升高而升高；當乳酸鈣濃度達到12.5 mmol/L時，乳液在室溫下貯藏28 d乳化指數達到1.00，乳液無乳析現象出現。

乳酸鈣影響乳滴粒度分布、乳滴形態及HMP膠束在油滴表面的吸附特性。在HMP中加入乳酸鈣，乳滴d（0.9）值略微減少；乳滴形態出現非規則圓球形；乳滴染色后發現乳滴表面有呈現紫紅色的細絲條紋附著物，推測該紫紅色附著物為HMP膠束。