多柔比星對心肌細胞焦亡及Caspase-3/GSDME信號通路的影響

張蕊，蔣磊，王志賢

安徽省第二人民醫院，合肥230041

細胞焦亡是細胞程序性死亡的一種，是指細胞 受到某些信號因子刺激，導致細胞主動消亡的病理生理過程。既往研究認為，細胞焦亡的形成機制可分為Caspase-1介導的經典型細胞焦亡和Caspase-4/5/11介導的非經典型細胞焦亡［1-2］。近年研究顯示，Caspase-3/焦孔素E（GSDME）細胞焦亡途徑在惡性腫瘤中發揮重要作用。焦孔素（GSDMs）是一個具有成孔效應的蛋白家族，能影響細胞膜通透性和細胞焦亡。GSDMs可與脂質結合，在細胞膜形成小孔，誘導細胞焦亡［1］。GSDME是GSDMs家族成員之一，其分子結構由兩個保守的結構域組成，即C-末端抑制結構域和N-末端效應結構域，其中N端具有細胞毒性。GSDME能夠被活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）剪切，形成具有細胞成孔作用的片段GSDME-N，導致細胞內容物如乳酸脫氫酶（LDH）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-18等釋放，誘導細胞強烈的炎癥反應［3］。研究表明，細胞焦亡參與了心血管疾病的發生發展。多柔比星（Dox）是一種蒽環類抗生素，廣泛用于肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的化療，心臟毒性是其主要不良反應［4］。目前，有關Dox導致心臟毒性的具體分子作用機制尚不完全清楚。2018年12月—2019年12月，我們觀察了Dox對大鼠心肌細胞H9c2焦亡的影響，探討其心臟毒性作用是否與Caspase-3/GSDME信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 主要材料 H9c2細胞（美國ATCC公司），高糖DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司）；多柔比星（Sigma公司）；DAPI細胞核染料（江蘇碧云天公司），Cleaved Caspase-3一抗（Cell Signaling Technology公司），GSDME-N一抗（Abcam公司），IL-1β、IL-18一抗（Proteintech公司）；細胞轉染試劑盒、GSDME siRNA干擾片段（廣州銳博公司），CCK-8檢測試劑盒、碘化丙啶檢測試劑盒（江蘇碧云天公司），LDH試劑盒（江蘇碧云天公司），IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（北京中杉金橋公司）。多功能酶標儀（Thermo Fisher），高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus），PCR儀、Western blotting檢測裝置（Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養與分組處理 向H9c2細胞中加入高糖DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，隔天換液。加入胰蛋白酶消化、吹打混勻，種植于6孔板內；貼壁生長24 h后，傾去細胞培養基。將細胞分為空白對照組、Dox組、GSDME轉染對照組和GSDME干擾組。空白對照組：加入高糖DMEM培養基培養；Dox組：加入4 μmol/L Dox培養8 h；而GSDME轉染對照組：轉染GSDME siRNA對照無干擾序列24 h后，加入Dox培養8 h；GSDME干擾組：轉染GSDME siRNA 24 h后，加入Dox培養8 h。

1.3 細胞焦亡情況觀察 采用碘化丙丁（PI）細胞染色法。收集各組細胞，加入4%多聚甲醛固定，PBS洗滌。避光條件下，加入PI染色液，室溫染色15 min。傾去PI染色液，避光條件下加入DAPI染色3～5 min，PBS洗滌。熒光倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照，以PI陽性細胞率表示細胞焦亡情況。PI陽性細胞率越高，細胞焦亡發生率越高。

1.4 細胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放情況觀察 收集各組細胞，離心收集上清液；采用比色法檢測LDH釋放量，ELISA法檢測IL-1β、IL-18水平。上酶標儀測定吸光度值，計算LDH釋放量。釋放量=（處理樣品吸光度值-空白對照吸光度值）/（全部釋放量孔吸光度值-空白對照吸光度值）×100%。

1.5 細胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將H9c2細胞離心后置于1.5 mL的EP管內，按照1∶3～1∶5加入細胞裂解液并充分震蕩裂解；用高速離心機4℃下以12 000 g離心15 min，收集細胞上清液，采用BCA法檢測蛋白質濃度。取40 μg蛋白上樣，行蛋白質凝膠電泳；濕轉轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h。加入相應的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶5 000），孵育1 h。TPBS洗滌，加入發光聚合物（ECL）；使用膠片曝光，將圖片掃描后用Image J軟件測定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內參β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。結果以-x±s表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PI陽性細胞率比較 空白對照組、Dox組、GSDME轉染對照組、GSDME干擾組PI陽性細胞率分別為10.85%±1.25%、65.50%±8.50%、62.89%±8.89%、30.21%±7.50%，Dox組、GSDME轉染對照組＞GSDME干擾組＞空白對照組（P均＜0.05），Dox組與GSDME轉染對照組差異無統計學意義。

2.2 各組細胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較 細胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量Dox組、GSDME轉染對照組＞GSDME干擾組＞空白對照組（P均＜0.05），Dox組與GSDME轉染對照組差異無統計學意義。見表1。

表1 各組細胞LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較（）

表1 各組細胞LDH、IL-1β、IL-18釋放情況比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Dox組比較，#P＜0.05。

images/BZ_28_234_402_1193_465.png空白對照組Dox組GSDME轉染對照組GSDME干擾組50.80±11.21 85.41±18.20*85.44±20.21*60.12±10.21#10.21±2.50 40.80±8.50*41.00±8.95*15.85±6.21#12.50± 2.59 35.21± 8.60*34.50±10.01*21.21± 7.50#

2.3 各組細胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達比較 與空白對照組比較，Dox組、GSDME轉染對照組細胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達均升高（P均＜0.05）；與Dox組比較，GSDME干擾組GSDME-N蛋白表達降低（P＜0.05），GSDME轉染對照組各指標差異無統計學意義。見表2。

表2 各組細胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表達比較（-x± s）

3 討論

Dox在有效抗腫瘤過程中，常伴隨嚴重的心臟毒性。研究發現，Dox靜脈注射后可迅速分布在心、腎、肝和肺等組織，而心臟組織中藥物的消除半衰期明顯高于其他組織［5］。有效解決Dox長時間滯留于心臟引發的心臟毒性，可為臨床合理使用Dox提供參考依據。研究發現，活性氧（ROS）過度產生是Dox造成心臟毒性的重要分子機制之一。ROS可以通過升高脂質過氧化產物，繼而導致心臟毒性［6］。線粒體損傷在Dox誘導的心臟毒性中同樣發揮重要作用，線粒體損傷可以導致ROS過量產生以及細胞色素C釋放增多［7］。此外，Dox還可誘導一氧化氮合酶高表達，釋放一氧化氮，促使心肌功能酶失活，導致心肌損傷［8］。

新近研究表明，細胞焦亡廣泛參與了心血管疾病的發生發展。細胞焦亡在形成機制和死亡形態上不同于以往其他類型細胞死亡，包括凋亡和細胞壞死［9-10］。以往文獻證實，細胞焦亡以細胞膜破裂為特征，PI染色劑可以通過破損細胞膜進入細胞核進而染色，而凋亡的細胞膜完整則無法通過，因此本文以細胞PI染色陽性表示細胞焦亡情況。本研究結果顯示，與空白對照組比較，Dox組PI陽性細胞率升高，表明Dox造成了心肌細胞焦亡；與Dox組比較，GSDME干擾組PI陽性細胞率降低，這表明干擾GSDME能有效抑制Dox誘導的細胞焦亡。LDH是活細胞胞質內含酶之一，在正常生理狀態下不能透過細胞膜；當靶細胞受損時，細胞膜通透性改變，LDH可以釋放至介質中。因此，細胞上清液中LDH含量可以反映細胞膜破損情況。IL-1β和IL-18是細胞焦亡發生時誘導炎癥的關鍵因子，其可通過細胞小孔釋放至細胞外誘導炎癥風暴。因此，細胞膜外IL-1β和IL-18水平可以反映細胞損傷以及炎癥狀況。本研究結果顯示，與空白對照組比較，Dox組細胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量均增加，表明Dox造成了細胞膜損傷，導致IL-1β、IL-18釋放，從而誘發細胞焦亡；與Dox組比較，GSDME干擾組細胞中LDH、IL-1β、IL-18釋放量降低，表明干擾GSDME能夠有效抑制Dox造成的細胞損傷以及炎癥反應。

在腫瘤細胞焦亡中，Caspase-3/GSDME依賴性細胞焦亡途徑發揮重要作用。Caspase-3是與細胞凋亡相關的關鍵蛋白，Cleaved Capase-3能夠誘導細胞凋亡，導致細胞功能紊亂［11］。GSDME是非經典細胞焦亡的關鍵蛋白，細胞高表達GSDME時，Cleaved Caspase-3亦可誘導 GSDME 依賴的細胞焦亡［12］。ZHANG等［13］報道，在肺癌A549細胞中，紫杉醇和順鉑能激活Caspase-3形成Cleaved Caspase-3，進而激活GSDME-N并誘導細胞焦亡。在胃癌細胞中，Dox能通過激活Caspase-3/GSDME途徑誘導腫瘤細胞焦亡［14］。在乳鼠心肌細胞中，Dox能通過活化Caspase-3和PARP-1，誘導心肌細胞凋亡［15］。高智明［16］研究發現，Dox能上調Cleaved Caspase-3表達，誘導大鼠心肌細胞肥大以及細胞凋亡，導致心肌損傷。本研究結果顯示，與空白對照組比較，Dox組細胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N 及 IL-1β、IL-18蛋白表達升高；與Dox組比較，GSDME干擾組GSDME、GSDME-N蛋白表達顯著降低，但是Caspase-3、Cleaved Caspase-3、IL-18、IL-1β蛋白無顯著變化，這表明Dox是通過GSDME依賴性途徑誘導的細胞焦亡。Caspase-3介導的下游信號GSDME依賴性細胞焦亡是獨立于細胞凋亡的一種新的死亡方式，通過基因干擾GSDME能夠降低LDH、IL-18和IL-1β釋放，證明Dox能夠通過Caspase-3/GSDME途徑誘導H9c2細胞焦亡。

綜上所述，Dox可通過Caspase-3/GSDME途徑誘導H9c2細胞焦亡，為Dox用于臨床治療腫瘤患者所引起的心臟毒性提供新的分子作用機制。后續研究中我們將通過在體動物實驗進一步明確Dox誘導心肌細胞焦亡的作用機制。