不同煎煮時間對茯苓飲片水溶性多糖含量的影響*

衛修來，盧雨晴，程鋼

1 安徽醫科大學第一附屬醫院 安徽合肥 230022

2 安徽省六安市人民醫院 安徽六安 237000

茯苓為多孔菌科真菌茯苓（Poriacocos （Schw.）Wolf）的干燥菌核，味甘、淡，性平，具有利水滲濕，健脾，寧心之功效，為中醫臨床常用藥物之一。《中國藥典》（2015年版，1部）將鮮茯苓按不同部位切制，陰干后，分為“茯苓塊”和“茯苓片”[1]。茯苓塊為方塊狀，較為厚；茯苓片為薄片，較茯苓塊長。茯苓的主要化學成分是多糖、三萜、脂肪、蛋白質等物質，其中茯苓多糖作為茯苓藥材的活性成分之一，具有提高機體免疫力的作用。[2]茯苓多糖包括水溶性多糖和醇溶性多糖[3-4]，臨床上通過傳統煎煮方法獲得的是水溶性多糖，本次實驗以水溶性多糖為指標，考察煎煮時間對兩種不同規格的茯苓飲片中水溶性多糖溶出的影響，這在一定程度上影響了茯苓的藥效。本實驗使用苯酚-硫酸法聯合3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[5-8]測定茯苓中水溶性多糖含量，苯酚-硫酸法測總糖含量，DNS法測單糖含量，二者之差為茯苓多糖含量。利用上述方法對茯苓飲片的2種規格（茯苓塊和茯苓片）不同煎煮時間水煎液中茯苓多糖含量進行考察，以此為中藥飲片的臨床使用提供參考。

儀器與試藥

1 儀器

TU-1810型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；2104型電子天平（上海天平儀器廠）；德爾（Deer）DH64型電熱恒溫干燥箱（上海醫療器械七廠）；H.H.S21-4型電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）； SZ-1型快速混勻器（金壇市華峰儀器有限公司）。

2 試藥

茯苓塊（安徽井泉中藥有限公司，產地安徽，批號為20180701、20180801、20180901，對應編號為A、B、C）；茯苓片（安徽井泉中藥有限公司，產地安徽，批號為20180301、20180401、20180701，對應編號為D、E、F），經安徽醫科大學第一附屬醫院葛朝亮副主任中藥師鑒定為茯苓塊和茯苓片，符合2015版《中國藥典》一部規定。葡萄糖對照品（批號：10042112，上海源葉生物科技有限公司）；苯酚（批號：20150503，上海聚泰特種試劑有限公司，分析純）；硫酸（批號：180504，無錫市展望化工試劑有限公司，分析純）；3，5-二硝基水楊酸（批號：14147181，廣州和為醫藥科技有限公司，分析純）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

方法與結果

1 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.01g，置100mL量瓶中，以水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.1g/L的葡萄糖對照品溶液①；同法制備濃度為1.0 g/L的葡萄糖對照品溶液②。

2 供試品溶液的制備

稱取各批次飲片各50 g，置2000 mL不銹鋼量杯中，加10倍量蒸餾水，浸泡30 min后置電磁爐上，大火煮沸后分別保持微沸15 min，30 min，45 min，趁熱以2層紗布過濾；各組藥渣再以8倍量蒸餾水大火煮沸保持微沸15 min，趁熱2層紗布過濾；合并兩次濾液，放至室溫，轉移至1000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，得濃度為0.05 g/mL的茯苓飲片水煎液。

3 苯酚-硫酸法測定水煎液中總糖含量

3.1 線性關系考察 分別精密吸取0.1g/L的葡萄糖對 照 品 溶 液 各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置 于6個10 mL刻度試管中，分別加水至1mL，精密加入5%苯酚溶液2mL，立即用快速混勻器混勻，以單標線移液管迅速加入5 mL硫酸，移液管硫酸流盡后靠壁15s，取出移液管，混勻后置于沸水浴中加熱15 min，迅速取出，置于冰水中冷卻3 min，取出混勻并放至室溫。以0 mL溶液為空白，在490 nm波長測定吸光度，以濃度C （μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A = 0.0072C + 0.0161（r=0.9997），結果表明葡萄糖濃度為21～75μg/mL時線性關系良好。

3.2 精密度試驗 精密移取茯苓總糖提取液0.5 mL、，加水補足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，依次連續測定6次吸光度，結果RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩定性試驗 精密移取茯苓總糖提取液0.5 mL，加水補足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，結果RSD分別為0.34%，表明茯苓總糖提取液中總糖顯色后在2 h內穩定。

3.4 重復性試驗 分別精密移取同一批次6份茯苓總糖提取液0.5 mL，加水補足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，測定吸光度，結果RSD分別為0.57%，表明苯酚-硫酸法的重復性良好。

3.5 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的茯苓總糖提取液28.755μg，平行6份，分別精密加入0.1g/L的葡萄糖對照品溶液28.000μg，加水補足至1.0 mL，按照“3.1”項下方法操作，于490nm波長下測定吸光度并計算回收率，平均回收率（n=6）為102.70%，RSD為1.23%，符合測定要求。見表1。

3.6 不同煎煮時間的茯苓總糖含量測定 分別精密吸取各批次傳統湯劑0.2mL于10mL量瓶中，加水稀釋至1mL，分別按照“3.1”項下方法操作，測定各批次傳統湯劑的吸光度，根據苯酚-硫酸法標準曲線和樣品濃度，計算各批次茯苓傳統湯劑中總糖的含量。

4 DNS法測定水煎液中單糖含量

表1 苯酚-硫酸法加樣回收率考察

4.1 線性關系考察 分別精密吸取1.0 g/L的葡萄糖對照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL于10 mL量瓶中，加水補足至2.0 mL，搖勻，分別精密加入DNS試液3.0 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱5 min，取出，迅速流水冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻。[9]以0 mL溶液為空白，在540 nm波長下測定吸光度，以濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A = 0.0182C- 0.1354 （r= 0.9999），結果表明葡萄糖濃度為20～51μg /mL時線性關系良好。

4.2 精密度試驗 精密移取茯苓總糖提取液2.0 mL，按照“4.1”項下方法操作，依次連續測定6次吸光度，結果RSD為0.37%，表明儀器精密度良好。

4.3 穩定性試驗 精密移取茯苓總糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，結果RSD為0.80%，表明茯苓總糖提取液中單糖顯色后在2 h內穩定。

4.4 重復性試驗 分別精密移取6份茯苓總糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，測定吸光度，結果RSD分別為0.46%，表明DNS法的重復性良好。

4.5 加樣回收率 精密吸取已知含量的茯苓總糖提取液178.479μg，平行6份，分別精密加入1.0g/L的葡萄糖對照品溶液160.000μg，加水補足至2.0 mL，按照 “4.1”項下方法操作，于540nm波長下測定吸光度并計算回收率，平均回收率（n=6）為101.06%，RSD為和1.15%，符合測定要求。見表2。

表2 DNS法加樣回收率考察

4.6 不同煎煮時間的茯苓單糖含量測定 分別精密吸取各批次傳統湯劑0.5mL于10mL量瓶中，加水稀釋至2mL，分別按照“4.1”項下方法操作，測定各批次傳統湯劑的吸光度，根據DNS法標準曲線和樣品濃度，計算各批次茯苓傳統湯劑中單糖的含量。

5 不同煎煮時間下茯苓多糖含量測定結果

茯苓片與茯苓塊測定結果見表3，表4。結果表明，茯苓飲片傳統湯劑中茯苓多糖含量隨煎煮時間的增加而增加，且煎煮45 min時茯苓片煎煮液中茯苓多糖含量與茯苓塊煎煮液相比無明顯差異，見圖1。

表3 不同煎煮時間下茯苓塊水煎液中茯苓多糖的含量

表4 不同煎煮時間下茯苓片水煎液中茯苓多糖的含量

討 論

圖1 不同煎煮時間下茯苓塊與茯苓片水煎液中多糖含量（■茯苓塊 ●茯苓片）

本實驗通過對茯苓飲片的15，30，45min3個不同煎煮時間進行考察，發現煎煮45min的茯苓傳統湯劑中茯苓多糖含量明顯較高，且煎煮15min的水煎液中茯苓多糖含量最小。根據圖1可知，茯苓水煎液在煎煮30～45min過程中，茯苓多糖增長率明顯低于煎煮15～30min。

在實驗研究初期，我們曾參照文獻嘗試采用了80%乙醇除雜過濾，再水提多糖以硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法測定多糖[10]，但因為茯苓中水溶性多糖含量很低（＜0.3%），往往需要較大的取樣量（≥2g），這樣在除雜過濾時較慢，吸附在殘渣上的單糖不易洗凈除去，從而使結果的重復性較差，不易獲得準確的結果。而另一種方法水提醇沉也需要多糖含量較高才能夠沉淀出來，少量的沉淀較為松散而易隨乙醇流失，在茯苓多糖的提取中顯然不具備優勢。本實驗采用的多糖含量測定方法為：水提總糖，測其總糖及單糖含量，兩者之差為多糖含量。本方法只需一次提取，避免因多次提取及轉移過濾造成的多糖損失，同時解決了因多糖含量較少而無法采用水提-醇沉法提取的問題，既保證了提取的充分，又大大減少了操作步驟及時間，且使整體實驗操作誤差減小。

DNS法作為茯苓單糖含量的測定方法，使用前需按紫外-可見分光光度法方法測定，在200～600nm范圍內進行掃描，結果表明樣品溶液最大吸收波長為505nm。在含量測定的實驗過程中，505nm波長下樣品溶液及空白對照所測吸光度均不穩定，推測該波長下溶液發生某種可逆的物理或化學變化。通過查閱相關文獻及報道，最終確定測量波長為540nm，[11]此時樣品溶液吸光度穩定且重復性和精密度均較好。

綜上所述，茯苓作為常用中藥，對不同煎煮時間傳統湯劑中多糖含量的考察在臨床用藥中有著較重要的意義。通過本實驗的初步探索可知，茯苓片水煎液中茯苓多糖與茯苓塊水煎液相比無明顯差異，且茯苓飲片在煎煮45 min時水煎液中茯苓多糖的含量最高。因此，在臨床上，茯苓塊和茯苓片均可作為茯苓飲片的常用規格使用；另一方面，在日常煎藥時，可在不影響其他藥材有效成分煎出的前提下適當增加煎煮時間。