益氣化濁膠囊預防性給藥對胰島素抵抗大鼠肝臟的影響*

劉玉楠，李祥，閆冬雪，郭俊杰

山西省中醫藥研究院 山西太原 030012

胰島素抵抗（IR）是指正常劑量的胰島素無法發揮相應生物效應的一種病理狀態。近年來多項研究表明，IR是2型糖尿病（T2DM）的核心機制并貫穿其發病始終。除此之外，它亦是肥胖、糖耐量異常（IGT）、血脂紊亂、動脈粥樣硬化、高血壓病等多種疾病的重要危險因素，會給個人及社會帶來巨大的經濟及心理負擔[1]。眾所周知，IR往往會伴發肝臟脂肪病變，進而影響肝臟功能受損，進一步加重IR，形成惡性循環。益氣化濁膠囊是導師在前人基礎上結合自身多年臨床經驗研制而成的院內制劑，前期實驗[2-7]表明該藥可有效防治IR，但缺乏該藥對肝臟影響的相關研究，故本實驗觀察益氣化濁膠囊預防性給藥對高脂飲食胰島素抵抗（IR）大鼠肝臟的影響，為該藥的安全性及防治IR、T2DM的臨床工作提供依據。

材料與方法

1 動物

SD大鼠，SPF級，雄性，6～8周 齡，體質量（220±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0004，合格證號：1103221911001377；普通飼料、高脂飼料[8-9]（普通飼料78.9%，精煉豬油10.00%，蛋黃粉10.00%，膽固醇1.00%，豬膽鹽0.10%）均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0008，生產批號：20190124。

2 藥物

鹽酸二甲雙胍片（規格：0.5g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：ABE4927）；益氣化濁膠囊（規格：0.5g/片，山西省中醫院制劑中心，批號：20190418）。

3 試劑

TG測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號：187951；TC測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號：182041；大鼠胰島素（INS）酶聯免疫吸附測定試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：NQ6THEXG2R。

4 儀器

電子天平：德國賽多利斯公司，型號：BP211D；微量血糖儀：美國強生公司，型號：穩豪倍優型；低速冷凍離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司，型號：KDC-1044；多功能微孔讀板機酶標儀：美國Bio Tek公司，型號：Synergy H1；石蠟切片機：德國萊卡，型號：RM2016；電腦生物組織攤烤片機：浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-T；光學顯微鏡：日本OLYMPUS，型號：BX43。

5 方法

5.1 分組與給藥 60只SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分6組，每組10只。空白對照組，模型對照組，鹽酸二甲雙胍組（陽性對照組，簡稱二甲雙胍組），益氣化濁膠囊高劑量組（簡稱益氣化濁高劑量組），益氣化濁膠囊中劑量組（簡稱益氣化濁中劑量組），益氣化濁膠囊低劑量組（簡稱益氣化濁低劑量組）。隨即各實驗組動物開始灌胃給藥，1日1次，連續8周。根據《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》計算實驗動物灌胃量。空白對照組和模型對照組為10mL/kg·d 等容積生理鹽水；二甲雙胍組為0.2g/kg·d鹽酸二甲雙胍片；益氣化濁高、中、低劑量組分別為2g/kg·d、 1g/kg·d、 0.5g/kg·d益氣化濁膠囊。以上藥物均按照70 kg成人每日每公斤體重服用藥物劑量的6.3倍的等效劑量及其倍比劑量計算。

5.2 模型制備 給藥同時造模，空白對照組普通飼料喂養；其余各組造模：高脂飼料喂養8周誘導IR大鼠模型。各組大鼠均自由攝食飲水，自然環境，明暗周期12h：12h。第8周末禁食不禁水過夜，空腹狀態下測體重，以3ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血液6ml，離心取血清，供測量血清學指標使用；迅速解剖大鼠取得肝臟，大量預冷的生理鹽水沖洗并用濾紙吸取多余水分，稱量肝臟濕重，并在每只大鼠肝臟同部位剪取10g左右放入預先準備的10%多聚甲醛固定液中，為病理切片準備。

6 指標觀測

6.1 體重、肝重、肝臟指數測定 電子天平稱取體重、肝臟濕重；根據公式計算肝臟指數，肝臟指數（%）=（肝臟濕重量/處死時大鼠體重）×100%。

6.2 甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）水平測定 全自動生化儀測定血清TG、TC水平。

6.3 血糖（FPG）、血清胰島素（FINS）水平測定及IR評價 快速血糖儀測得大鼠尾尖取血FPG；酶聯免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清FINS的水平，穩態模式評估法（HOMA-IR）評價IR水平，（HOMA-IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5。

6.4 肝臟病理切片制備 肝臟切片HE染色，觀察肝臟脂肪堆積情況。

7 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較則采用單因素方差分析（ANOVA），若方差齊性，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Dunnett'T3 多重比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠體重、肝重、肝臟指數比較

體重模型對照組顯著高于空白對照組（P＜0.01），二甲雙胍組、益氣化濁高劑量組均顯著低于模型對照組（P＜ 0.01）；肝重、肝臟指數模型對照組顯著高于空白對照組（P＜0.01），二甲雙胍組、益氣化濁高劑量組、益氣化濁中劑量組顯著低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2 各組大鼠TG、TC水平比較

TG水平模型對照組顯著高于空白對照組（P＜0.01），二甲雙胍組、益氣化濁高劑量組、益氣化濁中劑量組顯著低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）；TC水平模型對照組顯著高于空白對照組（P＜0.01），各給藥組與模型對照組相比未見顯著差異，見表2。

3 各組大鼠FPG、血清FINS、IR水平比較

FPG水平各組間無統計學差異；FINS水平、HOMA-IR模型對照組顯著高于空白對照組（P＜0.01），表明IR模型復制成功，二甲雙胍組、益氣化濁高劑量組、益氣化濁中劑量組顯著低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01），表明益氣化濁膠囊可以在一定程度上預防IR，見表3。

4 各組大鼠肝臟組織病理學觀察

肉眼觀察可見，空白對照組大鼠肝臟表面光滑，呈褐紅色，質地柔軟。模型對照組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，質地較韌。各給藥組情況居空白對照組與模型對照組之間，而各給藥組間無明顯差異。病理切片顯示：空白對照組大鼠肝小葉結構清楚，肝細胞索呈放射狀排列；模型對照組大鼠肝小葉結構破壞，大多數肝細胞腫脹，肝細胞出現明顯的脂肪病變，胞漿內出現大量的脂肪空泡，部分細胞核被空泡擠至一側。與模型對照組比較，各給藥組大鼠肝細胞脂肪病變不同程度減輕，其中以二甲雙胍組與益氣化濁高劑量組減輕明顯，見圖1。

討 論

肝臟作為IR的三大重要靶器官之首，其胰島素受體相當密集，對胰島素作用極為敏感，故先于其他組織發生IR，因此肝臟是研究IR的最為關鍵的器官。相關研究[10-11]表明IR與肝臟脂肪病變關系密切，相互影響，相互促進。長期高脂飲食攝入可引起內臟脂肪及其分解活性的增加，從使運送到肝臟的FFA增加，當進入肝細胞的FFA超過肝臟的氧化能力時，多余的脂質主要是以脂滴的形式存在，肝臟發生脂肪變性，最終導致肝臟IR[12]。肝臟IR發生時，一方面會使糖異生和肝糖輸出增加，肝臟脂質含量升高，引發FPG升高、血脂異常；另一方面，影響胰島素信號傳導，IRS酪氨酸磷酸化減弱，P13K/Akt信號通路受阻，從而使胰島素儲存及利用葡萄糖的功能減弱，加重全身IR[13]。

中醫學認為，肝臟脂肪病變多是飲食不節、過食肥甘之過，以致脾失健運，水濕不化，凝濕為痰，致痰濕氣滯或痰濁血瘀，或日久生濕化熱，致濕熱血瘀，其本質為本虛標實，脾虛為本，痰濕、血瘀等實邪為標[14]。而益氣化濁膠囊由黃芪、女貞子、蒼術、丹參、鬼箭羽、黃精、蠶繭組成，正有益氣養陰，活血化濁之效。現代藥理研究[15-16]表明黃芪多糖作為黃芪主要生物活性成分，能夠改善T2DM大鼠的IR及糖脂代謝紊亂。除此之外，黃芪有護肝作用[17]。女貞子、丹參、鬼箭羽、蠶繭、蒼術、黃精[18-20]均能在不同程度上降血糖、降血脂、提高機體的免疫力。故中醫基礎理論與中藥藥理研究均為益氣化濁膠囊預防性給藥可有效改善肝臟脂肪病變奠定了基礎。

表1 各組大鼠體重、肝重、肝臟指數比較（±s）

表1 各組大鼠體重、肝重、肝臟指數比較（±s）

組別 劑量/g·kg-1·d-1 體重/g 肝重/g 肝臟指數/%空白對照 - 417.00±15.39 9.78±0.9 2.29±0.19模型對照 - 468.50±31.66 13.67±1.22 3.01±0.07二甲雙胍 0.2 422.40±18.23 10.08±1.17 2.52±0.18益氣化濁高劑量 2 435.10±29.66 11.02±1.87 2.65±0.26益氣化濁中劑量 1 446.400±28.23 12.15±1.27 2.85±0.13益氣化濁低劑量 0.5 460.00±25.48 12.91±1.58 2.93±0.21

表2 各組大鼠TG、TC水平比較（±s）

表2 各組大鼠TG、TC水平比較（±s）

組別 劑量/g·kg-1·d-1 TG/mmol·L-1 TC/mmol·L-1空白對照 - 0.76±0.24 1.72±0.29模型對照 - 1.31±0.23 2.21±0.51二甲雙胍 0.2 0.84±0.12 1.98±0.30益氣化濁高劑量 2 0.84±0.12 1.91±0.38益氣化濁中劑量 1 1.10±0.17 2.07±0.33益氣化濁低劑量 0.5 1.17±0.22 2.15±0.27

表3 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比較（±s）

表3 各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比較（±s）

組別 劑量/g·kg-1·d-1 FPG/mmol·L-1 FINS/mIU·L-1 HOMA-IR空白對照 - 4.75±0.43 20.80±2.74 4.40±0.76模型對照 - 5.03±0.58 50.37±7.86 11.24±2.06二甲雙胍 0.2 4.76±0.48 31.29±4.45 6.57±0.70益氣化濁高劑量 2 4.80±0.47 33.32±4.37 7.14±1.33益氣化濁中劑量 1 4.89±0.52 38.46±4.08 8.38±1.44益氣化濁低劑量 0.5 4.97±0.54 46.75±4.81 10.38±1.94

圖1 6組大鼠肝臟病理組織學變化（HE染色，×200）

本研究采用高脂飲食誘導的方法復制IR模型。該造模方式具有省時、穩定的特點，是目前運用最廣泛的方式之一[21]。實驗結果表明，模型對照組大鼠具有IR伴肝臟脂肪病變的特點，而益氣化濁膠囊可顯著改善實驗大鼠IR及肝臟脂肪病變，其中以益氣化濁高劑量組改善最為顯著。

綜上所述，益氣化濁膠囊預防性給藥可明顯改善高脂飲食誘導大鼠IR，改善肝臟脂肪病變，即對肝臟有一定的保護作用，為該藥的應用安全性提供依據，為預防IR、T2DM奠定了一定基礎。