藏綿羊卵巢組織學及卵泡超微形態的觀察

郭亞軍，柳苗苗，付德海，冉興榮，王欣榮

(甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

哺乳動物發情周期按卵泡發育、排卵和黃體形成的規律可分為卵泡期和黃體期，兩者交替進行，主要受下丘腦-垂體-卵巢軸所分泌的激素調控[1]。黃體和卵泡的發育對于維持雌性動物正常的生殖至關重要。卵巢經歷卵泡發育和黃體形成與退化等一系列動態變化過程，也是主要性激素和生長因子產生的場所。研究顯示，卵巢能分泌雌激素、孕激素、雄激素、催產素、卵泡抑素、激活素及生長因子等物質[2]。卵泡和黃體的生理活動受神經激素的調節和外界環境條件的交互影響,而卵泡發育主要以卵泡波的方式出現，依次經歷原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡等階段[3-4]。在卵泡的生長發育過程中，絕大多數的卵泡會發生閉鎖和退化, 最終，只有少數卵泡能發育成熟至排卵[1, 3]。卵母細胞的發育狀況與卵泡發育過程的命運密切相關，受內分泌激素的調節和卵巢內細胞因子生理作用的影響[5-6]。

藏綿羊長期在高寒低氧環境下繁衍生息，其繁殖率低下，產羔率只有105%[7]。目前認為，藏綿羊發情率和排卵率不高是造成其產羔率低的主要原因，另外也是環境及遺傳因素交互影響的結果。目前，對于藏綿羊在卵巢發育過程中特別是卵泡及黃體的組織學變化，相關研究尚不多見。本研究采用解剖學和組織學方法，對藏綿羊的卵巢形態、卵泡和黃體的組織構造以及卵泡的超微形態進行觀察，探討組織學特征與其生理功能的關系，以揭示藏綿羊在發情期卵巢的組織學變化，為今后生產實踐中采取合適的繁殖調控措施、提高產羔率提供理論依據，也可為高原家畜卵巢生理學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年9月在甘肅省夏河縣(海拔3 200 m)采集12只成年(2～3歲)、平均體重為38.3～46.4 kg的健康藏綿羊雙側卵巢，根據表面特征將樣本分為卵泡期和黃體期卵巢，各12枚。卵泡期卵巢表面光滑、形狀扁圓、顏色呈半透明、觸感較軟、富有彈性和波動感，表面有類似黃豆大小的紅色斑塊；黃體期卵巢表面粗糙且觸感較硬，可見紅色扁平狀或錐形的突起，形狀呈不規則的三角形，其大小占據卵巢體積的2/3。

1.2 主要儀器設備及試劑

石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司 RM2016)；正置光學顯微鏡(日本尼康)；游標卡尺(上海恒量量具有限公司，0～150 mm)；自動脫水機、包埋機和凍臺(武漢俊杰電子有限公司 JJ-12 J、JB-P5、JB-L5)；組織攤片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司 KD-P)；波切片機(Leica UC7)；透射電子顯微鏡(HITACHI HT770)；烤箱(天津市萊玻瑞科儀器設備有限公司 GFL-230)；顯微鏡(Olympusdp-71)。蘇木精染液(武漢谷歌生物科技有限公司)；無水乙醇、二甲苯、鹽酸和中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)；電鏡固定液(Servicebio)；812包埋劑(SPI)。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵巢物理參數的測量和組織切片制作 分別測量左、右兩側卵巢的長、寬、厚并稱重，取3 cm3新鮮組織，置于4%甲醛固定液中固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片和烤片，脫蠟至水后將切片用蘇木素染色，鹽酸分化，氨水反藍，水洗后依次投入梯度酒精中脫水，再入伊紅染色，無水乙醇、二甲苯中透明，然后用中性樹膠封片，鏡檢和采集圖像。

1.3.2 透射電鏡制片步驟 取新鮮卵巢皮質部組織塊，進行修塊，體積為1 mm3，迅速投入4 ℃電鏡固定液中固定4 h。先用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次，15 min·次-1，再用1%餓酸和0.1 mol·L-1磷酸緩沖液室溫固定2 h，最后，再用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3次，15 min·次-1。將組織依次從50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精、100%的丙酮中各脫水15 min。置于丙酮和包埋劑等體積混合稀釋滲透2 h，丙酮和包埋劑按2∶1稀釋滲透過夜，而在純包埋劑中滲透7 h后置于包埋板中37 ℃ 過夜，60 ℃聚合48 h后,用超薄切片機超薄切片，厚度為60～80 nm，進行鈾鉛雙染色后(2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，置于透射電子顯微鏡下進行圖像采集與分析。

1.4 數據采集與分析

組織切片制作完成后置于顯微鏡下觀察并對重復3個以上的視野進行拍照，采集其整體或局部照片，運用Image pro plus 6.0軟件測量卵泡的物理參數。用游標卡尺測定卵巢的長、寬、厚等指標。數值用SPSS 19.0進行T檢驗，分析差異顯著性，其結果用“平均數±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 藏綿羊卵巢的物理特征和組織形態

卵巢發育階段主要以卵泡和黃體的特征為劃分依據，卵泡期卵巢主要由處在不同發育時期、大小不等的卵泡組成，大多數卵泡靠近卵巢表面呈石榴籽樣(圖1A)。黃體期的卵巢呈橢圓狀，其邊緣有錐口形和火山口型的兩種黃體類型(圖1C)。測定顯示，卵泡期和黃體期卵巢的長度和重量無顯著差異(P>0.05)，而寬度和厚度差異顯著(P<0.05)。此外，卵巢皮質和髓質的面積分別占卵巢實質的面積比例也不同，卵泡期卵巢的皮質面積占比大于黃體期(表1)。解剖時根據卵泡直徑大小將其劃分為3類，分為大(直徑>5 mm)、中(3 mm<直徑<5 mm)、小(直徑<3 mm)卵泡(圖1A)。切片觀察顯示，卵巢皮質有許多不同發育時期的卵泡，以及卵泡的副產物紅體和黃體；卵巢基質中含有膠原纖維、網狀纖維、平滑肌纖維及細小血管；中央髓質范圍較小，主要由疏松結締組織和豐富的血管構成(圖1E)；卵巢門系膜處有許多上皮樣細胞和靜脈血管以及輸卵管傘形成的大量小血管通過卵巢門進入卵巢髓質(圖1B、1D)。

表1 卵巢組織的物理學參數

A.卵泡期卵巢, 表面有大小不等的卵泡; B.卵巢門處的上皮樣細胞群和平滑肌; C.暗紅色的肉團狀突起的黃體: CL.黃體; D.卵巢門處的輸卵管傘部特征; E.卵巢組織結構橫切圖：F.卵泡; TA.白膜; CH.紅體; C.皮質; M.髓質; FA.卵泡腔; AF.閉鎖卵泡

2.2 藏綿羊黃體的組織學特征

觀察可見，卵泡內膜和顆粒細胞發生黃體化時先形成紅體(圖2A)。卵泡內膜的毛細血管逐漸伸入腔內，顆粒細胞體積增大，卵泡液逐漸消失且卵泡腔出現許多黃體小梁(圖2B、D)。卵泡顆粒細胞黃體化后形成顆粒黃體細胞，卵泡內膜細胞變圓，形成膜黃體細胞，并成團聚集分布于皺褶處(圖2C)。隨著黃體進一步發育成熟，結締組織和小梁消失，兩種細胞開始增生且結構明顯，顆粒黃體細胞體積顯著增大呈橢圓形，直徑約為50 μm，胞質呈深紅色，胞核大而圓，核仁染色淺且位于黃體中央。膜黃體細胞主要分布在黃體的周邊部，隨著結締組織深入，分散于顆粒黃體細胞之間，數量相對較少，胞質和核染色深，胞體小呈紡錘狀，直徑約為22 μm。此時，黃體內形成豐富的毛細血管且參差交替在其中，顆粒黃體細胞間也存在豐富的網狀纖維和血管，尤其是以血管為中心呈條帶狀和放射狀分布(圖2E、F)。

A.卵泡形成早期紅體; B.血管破裂形成紅體; C.紅體黃體化; D.紅體發生纖維化形成黃體小梁; E.黃體組織結構特征; F.黃體的結構特點: V.血管; GLC.顆粒黃體細胞; TLC.膜黃體細胞

2.3 藏綿羊卵泡的組織學特征

研究顯示，原始卵泡數量多且排列于皮質淺層，體積較小，直徑為36.4～38.4 μm，面積為1 366.4～1 768.2 μm2，卵泡細胞與周圍的結締組織以薄層基膜相隔(圖3A)。原始卵泡中的初級卵母細胞染色質細小且染色淺，核仁明顯呈扁圓形，直徑為8.3～10.2 μm。初級卵泡的直徑為60.3～70.2 μm，面積為4 202.2～4 313.9 μm2，卵母細胞的直徑為28.6～35.6 μm，初級卵泡中的卵泡細胞呈明、暗交替分布，明細胞數量占絕大數，胞核呈扁圓形或圓形，著色深，胞質飽滿，暗細胞則相反(圖3B)。觀察發現，有些處在發育期的初級卵泡，其卵泡細胞層分布不均勻，一側為多層，另一側僅有一層，而卵母細胞多位于間隙密的一側(圖3C)。次級卵泡的周圍由兩層卵泡膜包裹，而卵泡外膜和內膜內部有毛細血管滲透于內外之間，這一時期的卵泡直徑和面積分別為91.4～95.7 μm和5 382.7～8 277.2 μm2，當卵泡細胞增殖到6～12層，卵泡細胞由扁平形變成立方形，此時，透明帶出現且厚度約3.5 μm(圖3D)。三級卵泡的顆粒細胞間出現一些含液體的不規則腔隙且呈月牙形，隨著卵泡發育，一側的小腔逐漸融合成較大的半月形腔，腔內充滿大量卵泡液，此時，卵泡直徑為95.7～221.5 μm，透明帶厚度為4 μm，卵泡腔增大促使卵母細胞及周圍的顆粒細胞被擠壓于一側形成卵丘結構，其余的顆粒細胞被擠壓則緊貼腔面周圍，形成壁層顆粒細胞(圖3E)。成熟卵泡體積達到最大，其直徑為4.4～5.6 mm、面積可達1.5～2.3 mm2，但數量極少,此時，卵泡液占據整個卵泡腔，使顆粒細胞層變薄而細胞間隙增大，放射冠與周圍顆粒細胞之間聯系松弛，卵泡內外膜分層更為明顯，卵丘-卵母細胞復合物靠近卵泡腔一側且緊貼卵泡內膜(圖3F)。

A.原始卵泡; B、C.初級卵泡; D.次級卵泡; E.三級卵泡; F.成熟卵泡。PO.初級卵母細胞; FC.卵泡細胞; CT.結締組織; ZP.透明帶; TFI.卵泡內膜; TFE.卵泡外膜; TF.卵泡膜; SG.顆粒層; FA.卵泡腔; CR.放射冠

2.4 藏綿羊不同類型卵泡閉鎖的狀況

結果顯示，在初級卵泡和次級卵泡的閉鎖過程中，卵母細胞會退化或消失，而卵泡壁細胞也發生退化(圖4A)。生長卵泡的閉鎖存在兩種不同形態，分別是實心卵泡和囊狀卵泡。實心卵泡的顆粒層和卵泡膜都向內收縮、增生且向內伸展而占據整個卵泡腔(圖4D、E)。囊狀卵泡首先是顆粒層和卵泡膜萎縮，或僅是顆粒細胞發生萎縮而卵泡膜黃體化、透明化或纖維化，卵泡腔內維持原狀(圖4B、C)。觀察發現，卵泡壁細胞在閉鎖過程中的明顯特征是核固縮和細胞質擴散，顆粒層的基膜即卵泡內膜發生皺褶、加厚，還會發生透明化和纖維化，另外，顆粒細胞在卵泡腔有明顯的殘余(圖4F)。

A.卵泡內膜纖維化; 其中有顆粒細胞的殘余(a); B.卵泡膜內膜(b)發生纖維化; C.囊狀卵泡的閉鎖,其中顆粒細胞層發生肥大萎縮(b), 卵泡腔發生皺縮(a); D.實心卵泡閉鎖,卵泡膜致密化(c), 顆粒層萎縮內折占據卵泡腔(b), 卵母細胞閉鎖(a); E.閉鎖早期的卵泡,顆粒細胞固縮或萎縮(a), 顆粒層和卵泡膜纖維化; F.顆粒細胞發生固縮(a), 卵泡內膜發生肥大(b), 卵泡膜外膜發生透明化(c)

2.5 藏綿羊卵泡的超微形態

通過透射電鏡觀察發現，卵泡主要由大量卵泡細胞呈環繞狀排列在周圍，可見明、暗類型的細胞交替存在，其明細胞的數量明顯高于暗細胞，卵泡細胞為單層扁平細胞，卵泡細胞及其核均呈扁圓形，核質染色深且大，與長管狀的膜細胞通過縫隙相連(圖5A、C)。隨著卵泡的發育，細胞器數量也逐漸增加，核左側的分布多于右側。胞質中可見成束的微絲，早期卵泡的線粒體為圓形且數量較少，而到達生長卵泡時，線粒體呈長扁形且數量較多,與周圍的粗面內質網緊密相連，還見少量的溶酶體、高爾基體和核糖體分布于此(圖5D、5E)。細胞質中出現一些體積較小的多腔空泡，也可見從細胞核分泌的分泌物進入胞質(圖5F)。顆粒細胞增生多層時，細胞呈多邊形或立方形，胞質中細胞器豐富，細胞核染色較深。觀察發現，早期線粒體呈圓形，后期直徑變小，形狀呈啞鈴型，含大量的嵴，有時與內質網和高爾基體相連接。觀察發現，不同階段卵泡細胞中高爾基體和核糖體的數量較少(圖5E)。胞質中可見脂滴，染色較淺，有時可見卵泡細胞之間通過細胞膜突觸連接，其內靠近卵母細胞的卵泡細胞通過微絨毛可深入穿越于透明帶，與其卵母細胞通過橋粒和縫管連接，卵母細胞和卵泡細胞接觸區域存在吞飲小泡(圖5B)。

A.卵泡細胞; B.初級卵泡的一部分; C.卵泡細胞和卵泡膜; D.早期卵泡中的線粒體; E.初級卵母細胞的一部分; F.初級卵母細胞核及分泌顆粒。FC.卵泡細胞; LY.溶酶體; D.橋粒; CG.皮質顆粒; Mv.微絨毛; M.線粒體; SER.滑面內質網; MB.多泡體; N.細胞核; TC.膜細胞; Mf.微絲; LD.脂滴; RER.粗面內質網; M.線粒體; G.高爾基體

3 討 論

本研究發現，藏綿羊卵巢組織學特征和卵泡超微結構與其他哺乳動物基本相似，但藏綿羊卵巢卵泡和卵母細胞的直徑與其他山羊存在差異[8]，分析可能是不同飼養方式和品種的遺傳特性與環境互作的結果。藏綿羊原始卵泡和初級卵泡隨著發育程度的提高，其位置越靠近卵巢內部，而次級卵泡位于皮質和髓質交界區域，卵泡膜血管豐富，這與其他對低海拔山羊的報道相似[9]。有學者研究人胚胎卵巢發現，一旦第一個卵泡形成，則意味著卵泡的發育開始[10]，還有學者認為，原始卵泡發育過程中有任何改變,將會對雌性生育和健康產生重要影響[11]。本研究發現，藏綿羊原始卵泡數量多且呈動態變化，大多會發生閉鎖；有些則會出現兩個細胞核，而只有少數卵泡會進一步發育成初級卵泡。另外，在藏綿羊初級卵泡中發現,有明、暗兩種卵泡細胞類型，該現象也出現在水貂[12]、金色倉鼠[13]及人[3]的卵巢中，推測可能是一種卵泡的退化現象。

相關研究證實，卵泡閉鎖受多種因素的綜合調節，其中顆粒細胞的凋亡是卵泡閉鎖的重要原因[14-15]，本研究發現，不同階段卵泡中都存在卵泡閉鎖。產羔數較少的綿羊最終發育到成熟階段的卵泡相對卵泡總數而言,數量很少，而藏綿羊卵泡發育過程中能夠發育成熟的卵泡數量更少，這可能與優勢卵泡的形成機制有關。另外，有學者觀察到，山羊透明帶自生長卵泡初期開始形成，隨著卵泡發育而逐漸增厚，這與藏綿羊透明帶的出現時間和厚度變化的研究結論相似[8]。而在牛、人以及其他哺乳動物中，卵泡透明帶出現的時期迥異[3，16]，這可能反映了種間差異及環境互作的不同。有研究認為，藏綿羊卵巢微血管在卵巢門處螺旋程度更高，包裹更緊密，該特征可調節卵巢內的血流速度，被認為是藏綿羊適應高原低氧環境的一個重要形態學特點[17]。本研究也發現，在藏綿羊的卵巢門處，有大量小血管進入卵巢髓質，之后，呈小分枝放射狀進入皮質部，然后，分生出許多毛細血管以供給卵巢的養分需要。

研究表明，家畜黃體細胞分泌的孕酮能夠抑制垂體所分泌的促卵泡素，對母畜發情起負反饋作用[18-19]。牛、綿羊、豬、大鼠、兔、猴和人均在形態和生化上有明顯不同的合成類固醇激素的黃體細胞[3-4]。本研究顯示，藏綿羊黃體由顆粒黃體細胞和膜黃體細胞構成，其形態特征明顯，直徑大小顯著，其組織學特征與其他羊的基本相似[20]。另有研究表明，東北梅花鹿、東北細毛羊卵泡細胞中的細胞器主要位于細胞核兩側的胞質中，這與本研究中藏綿羊卵泡胞質中細胞器的分布特征一致[21-22]。藏綿羊卵泡膜位于外周胞質中可見游離的線粒體、核糖體和內質網聚集在核的兩側。有學者研究發現,在豚鼠胚胎的卵泡細胞之間可觀察到縫隙連接,但卵泡細胞與卵母細胞之間沒有發現[23]，這與本研究的結果類似，即在藏綿羊的卵泡細胞之間也存在縫隙連接，而卵泡細胞與卵母細胞之間是通過橋粒相連。因此推測，這種結構可能是兩者進行物質交換和信息交流的樞紐。另外本研究發現，隨著卵泡的發育，細胞核逐漸靠近質膜，其核仁是合成、加工核糖體亞單位的裝配場所[24-25]，本研究觀察到，胞質中有分泌的皮質顆粒，這也進一步證實了核仁具有重要生理功能。相關研究顯示，在山羊和豬的卵巢中，隨著卵泡的發育,胞質基質的電子致密度逐步增大，線粒體、核糖體和粗面內網等的致密度也顯著增加，說明卵母細胞的生長發育與周圍的卵泡細胞密切相關[22, 26]，這與本研究的結果相似，隨著卵泡的發育，藏綿羊卵母細胞胞質中的線粒體、高爾基體、內質網的形態也發生相應變化，其致密化程度增強。但藏綿羊作為低氧適應家畜，雖然其卵泡發育過程中的細胞學變化與其他動物基本一致，但其適應高原低氧環境、維持卵泡發生與排卵的細胞學機理仍不明朗，有待繼續深入研究。

4 結 論

本研究顯示，藏綿羊的卵巢形態與組織學特征、卵泡的超微形態與綿、山羊的類似，但隨著血管的增生,藏綿羊的卵泡發育和黃體形成較快，卵泡閉鎖在各個時期均有發生；本研究發現，在藏綿羊初級卵泡中有明、暗兩種卵泡細胞類型，卵巢門處有大量的微血管供血方式；隨著卵泡的發育，胞質中細胞器形態發生改變且致密化程度增加。本研究表明，藏綿羊的卵泡系統、黃體組織學特點及卵泡的超微形態能夠保障卵巢在高原低氧環境中機能的正常發揮。