豬CA5B基因的序列特征和表達分析

郭 晉，范新浩，楊亞嵐，梁國明，唐中林,*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2.中國農業科學院農業基因研究所，廣東嶺南現代農業科學與技術實驗室，深圳 518120)

碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CAs)是一類可催化二氧化碳和碳酸氫鹽的可逆水合金屬酶[1]，在不同物種的組織和細胞中表達水平不同[2]。由于CAs抑制劑與糖異生、尿素生成、脂肪生成、腫瘤發生等多種生理反應有關[3-4]，CAs抑制劑現已成為肥胖和腫瘤等疾病治療的藥物[5-6]。線粒體(mitochrodria, MT)通過它自身表達的DNA、細胞質中核基因編碼的蛋白質和酶完成細胞內的生物氧化過程[7]。研究發現，線粒體CA調節葡萄糖的氧化代謝、ROS的產生和氧化應激、線粒體的生物發生[8]。線粒體碳酸酐酶兩種同工酶CA5A(carbonic anhydrase，mitochondrial，5A；CA5A)和CA5B(carbonic anhydrase，mitochondrial，5B；CA5B)(以前被稱為CAVA和CAVB)在線粒體丙酮酸代謝中發揮關鍵作用，其通過可逆水合二氧化碳產生HCO3-：CO2+為丙酮酸轉化為草酰乙酸提供HCO3-，使草酰乙酸進入三羧酸循環途徑，是葡萄糖有氧代謝過程的關鍵底物。

人源碳酸酐酶(hCAs)參與大量的生理和病理過程，包括糖異生、脂肪生成、尿素生成、致瘤性以及各種病原體的生長和毒性[6, 10]，CA5(以前被稱為CAV)在糖異生、脂肪生成[6]、代謝調控[8, 11]和疾病發生[6, 8, 11-12]中發揮關鍵作用。目前，這些hCAs已作為藥物靶點被深入研究，幾種hCA抑制劑已在臨床應用[6]。小鼠線粒體碳酸酐酶CA5B與CA5A具有同源性[13]，小鼠CA5B基因在成年皮下脂肪和生殖器脂肪中表達量最高，小鼠胰島細胞中CA5在功能上可能與調節胰島素分泌有關[14]，此外，小鼠CA5參與調節脂肪細胞的丙酮酸羧化[15]和丙酮酸糖異生[16]。雙敲除(double knockout，DKO)CA5A和CA5B使小鼠高氨血癥增強和空腹血糖降低，表明CA5A和CA5B有助于尿素生成和調節糖異生[17]。

豬是人類最重要的蛋白來源和生物醫學模式動物之一。碳水化合物和脂肪是參與能量代謝的主要物質，因此，研究分析豬代謝相關基因對于肉品質的改良有重要作用。目前，豬CA5B基因還沒有注釋，其表達及調控機制尚不清楚。本研究利用豬轉錄組數據分析CA5B基因在發育過程中的表達特征以及組織中的表達情況，為研究CA5B的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集240日齡貴州小型豬(公、母各3頭)的心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長肌、睪丸、卵巢組織。此外，采集通城豬和長白豬各27個生長發育時間點(出生前33、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105 d和出生后0、9、20、30、40、60、80、100、120、140、160、180 d)的骨骼肌，每個品種每個時間點采集3頭豬。上述組織樣品立即現場液氮快速凍存，然后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗設備及試劑

臺式低溫離心機(Ependorff)、樣品研磨儀(Tekmar)、制冰機(SANYO)、1.5 mL離心管(AXY-GEN)、總RNA提取試劑盒(天根)。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取 取低溫保存的豬上述各種組織樣本提取總RNA，提取流程參照天根試劑盒說明書，提取的總RNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 RNA轉錄組測序 取凍存的RNA，根據Illumina?TruSeqTMRNA樣品制備流程，構建cDNA 文庫，利用Illumina HiSeqTM2500，采用雙端測序方法進行轉錄組測序，測序數據已上傳至NCBI數據庫(GSE73763和PRJNA488311)。

1.3.3 RNA測序數據處理 用TopHat2[18]將得到的RNA測序數據比對到豬的參考基因組上，經過注釋和計算，得到CA5B基因在各個樣本中RPKM(每萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數)的表達情況。

1.3.4CA5B功能預測 從NCBI數據庫下載豬、人、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B基因的蛋白質序列，利用EBI的多序列比對軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對不同物種的CA5B進行多序列比對分析，利用STRING數據庫(https://string-db.org)分析CA5B與其它蛋白的相互作用，利用DREP[19]數據庫(http://www.rnanet.org/editing/)分析CA5B潛在的RNA編輯位點，利用Targetscan、PicTar和miRanda工具預測CA5B基因的 3′UTR區域與miRNA結合位點，用R語言的cor.test()函數計算CA5B基因和miRNA表達量之間的相關系數。

2 結 果

2.1 CA5B的序列保守性分析

由于小鼠和人CA5B基因功能已有報道研究，為了探究豬CA5B基因功能，首先分析了豬、小鼠與人CA5B基因的保守性。從NCBI數據庫下載豬(XP_020935797.1)、人(EAW98898.1)、小鼠(NP_851832.2)、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B蛋白序列，利用EBI的多序列比對軟件Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行多序列比對分析。圖1為10個物種蛋白編碼序列的比對結果，在人、豬、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓中，除小鼠外，其余序列相似性均在90%左右；就豬、人和小鼠的比對結果來看，豬和小鼠CA5B序列一致性為86.4%，而豬和人同源性為90.5%。說明豬CA5B蛋白序列與人相似度更近，與小鼠次之。

2.2 CA5B的系統發育樹

為研究CA5B基因在不同物種中的進化關系，利用MEG5軟件，以豬、人、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、狗和貓的CA5B的蛋白序列構建系統發育樹。結果發現，豬、狗與貓CA5B聚為一支，牛、綿羊與山羊CA5B聚為一支，這兩支屬于同一大分支，與人、猴CA5B具有相同的來源。這8個物種與馬聚為一大支，最后與小鼠CA5B聚為一支(圖2)。表明，與小鼠相比較，豬與人CA5B在進化上更近。

圖2 CA5B序列的系統發育樹

2.3 CA5B的蛋白互作網絡分析

利用STRING數據庫(https://string-db.org)分析CA5B與其它蛋白的相互作用。結果發現，與CA5B互作的蛋白包括TMEM35、CYP24A1和XPNPEP2等基因編碼的蛋白質(圖3)。通過在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/uniprot/)中檢索發現，與CA5B蛋白互作的這些基因在豬中的注釋較少，在人和小鼠中有較多注釋。

圖3 CA5B的蛋白互作網絡

CA5B互作蛋白功能：跨膜蛋白(transmembrane protein 35A，TMEM35)在細胞的過氧化物酶體中釋放的可溶性肽可調節神經元軸突的生長；雄性至死因子3(male-specific lethal 3, MSL3)具有組蛋白乙酰轉移酶活性及與甲基化組蛋白結合功能，在染色質重塑和轉錄調節中發揮作用；溶質載體家族成員(solute carrier family 25 member 30, SLC25A30)為在小鼠和人心肌、骨骼肌中特異性表達的線粒體轉運蛋白，完成線粒體內外的物質運輸；富含脯氨酸的Gla 1(proline rich Gla 1,PRRG1)可編碼跨膜蛋白TMEM171，可與鈣離子結合；細胞色素P450(cytochromeP450, family 24, subfamily a, polypeptide 1,CYP24A1)基因編碼的蛋白質作用于線粒體，其將骨化三醇降解為骨化醇，在維生素D分解和鈣穩態中起關鍵作用；TXLNG(taxilin gamma, taxilinγ)基因可編碼類肌球蛋白卷曲螺旋蛋白，在人和小鼠的細胞內囊泡運輸中發揮作用，可能參與調控細胞周期和調節骨密度，該基因的表達可能引起脂多糖的上調；肽酶M20結構域(peptidase M20 domain containing 2,PM20D2)編碼氨基酰化酶和氨基水解酶，催化蛋白質水解；X-脯氨酰氨肽酶2(X-prolyl aminopeptidase 2,XPNPEP2)基因編碼氨基肽酶，催化鄰近脯氨酸殘基的N端裂解。

根據CA5B蛋白互作網絡關系中互作蛋白的功能，推測CA5B可能參與調節生長和發育，線粒體內物質轉運和線粒體外跨膜運輸，并且可能與骨骼肌鈣穩態調節、細胞蛋白質分解、脂多糖代謝調控有關。

2.4 CA5B基因的組織表達譜

為了研究CA5B在各組織器官中的表達特點，本研究利用已有的貴州小型豬心、肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長肌、睪丸、卵巢9種組織的RNA數據[20]，分析CA5B在各種組織器官中的表達水平。結果發現，CA5B在成年豬的脂肪、睪丸、卵巢中高表達，在骨骼肌、心肌和腎中表達水平較低(圖4)。

圖4 CA5B基因在豬中的組織表達譜

2.5 CA5B在骨骼肌生長發育中的時序表達

為了了解CA5B在骨骼肌生長發育過程中的作用，本研究利用已有的高通量測序數據，首次分析了該基因在通城豬和長白豬27個生長發育時間點(E33-D180)中骨骼肌的動態表達。發現，CA5B的表達水平在通城豬和長白豬的胚胎期高于出生后時期，在胚胎期逐漸升高，出生后降低；并且在胚胎發育后期80 d(E80)到出生0 d(D0)表達水平較高，通城豬在胚胎期80 d(E80)時表達水平最高，而長白豬在胚胎期85 d(E85)時表達水平最高(圖5)。可以推斷，在通城豬和長白豬骨骼肌生長發育過程中，CA5B基因在胚胎期有重要作用，并且在胚胎骨骼肌發育后期至出生前發揮重要功能。

圖5 CA5B在通城豬和長白豬27個生長發育時間點骨骼肌中的動態表達

2.6 CA5B的RNA編輯

為探究CA5B的RNA編輯位點，在DREP[19]數據庫(http://www.rnanet.org/editing/)中分析CA5B潛在的RNA編輯位點，結果在CA5B基因的內含子區域和3′UTR區域分別找到了1個和2個A-to-G類型的RNA編輯位點，這3個位點均位于重復元件Pre0_SS區域，屬于SINE/tRNA家族(表1)。

表1 CA5B的RNA編輯位點信息

2.7 CA5B與miRNA結合的生物信息分析

為找到可能調節CA5B的miRNA，本研究利用Targetscan、PicTar和miRanda工具預測CA5B基因的 3′UTR區域與miRNA的結合位點，結果發現，ssc-miR-22-5p可以與CA5B基因 3′UTR靶向結合(圖6)。通過計算CA5B基因和miRNA表達量之間的相關系數和P值，發現CA5B與ssc-miR-22-5p在豬骨骼肌生長發育過程中的表達呈顯著負相關(R=-0.31,P=0.022，圖7)。表明CA5B的表達潛在受ssc-miR-22-5p調控。

圖6 CA5B與miR-22-5p靶向結合序列

圖7 CA5B與miR-22-5p表達相關性

3 討 論

線粒體在細胞和組織代謝中發揮重要作用，CA在線粒體內不可或缺而被廣泛研究。CA5B和CA5A是線粒體丙酮酸代謝的重要底物，在葡萄糖有氧代謝過程中發揮關鍵作用。從組織表達情況來看，小鼠CA5B和CA5A的表達呈現出不同的組織特異性，在大多數組織中都檢測到CA5B，而CA5A的表達僅限于肝、骨骼肌和腎[13]。從序列上來看，CA5A基因序列在小鼠和人之間有78%相似性，CA5B基因序列在小鼠和人之間有95%相似性，CA5B的保守性更高[13]。人和小鼠CA同工酶序列之間的系統發育樹表明，CA5B和CA5A都是從人和小鼠的祖先基因進化而來，并已經進化出了不同的生理作用[13]。本研究將小鼠CA5B的蛋白結構域序列與人和豬報道的CA5B結構域序列進行比較發現，CA5B結構域在豬和人之間的保守性(90.5%一致性)高于豬和小鼠CA5B保守性(86.4%一致性)。系統發育分析顯示，人和豬CA5B在進化樹上優先聚為一類，最后與小鼠聚在一起。因此，可以推斷CA5B基因在物種間的保守性更高。

根據分析結果發現，CA5B蛋白互作網絡中的基因編碼肌球蛋白卷曲螺旋蛋白、鈣穩態調節蛋白、線粒體跨膜蛋白、線粒體轉運蛋白以及氨基水解蛋白。據文獻報道，離子通道和代謝底物轉運中，人線粒體溶質載體SLC家族與CA5B蛋白表達相關[21]，推測CA5B在豬中可能也參與調控線粒體內物質轉運過程，在線粒體內能量代謝中發揮重要作用。根據CA5B高表達于豬的脂肪、睪丸和卵巢組織，這些都是ATP合成和利用的重要組織器官。CA5B基因在小鼠成年皮下脂肪和生殖器脂肪表達量最高，其參與調節脂肪丙酮酸羧化[15]、糖異生和尿素生成[17]。因此，推測CA5B在豬中可能也參與調控糖和脂肪的代謝。在豬骨骼肌27個生長發育時間點中，CA5B基因胚胎期表達水平高于出生后時期。推測豬的CA5B與骨骼肌生長發育以及能量儲存和利用有密切關系。與此同時，還發現CA5B可能受ssc-miR-22-5p調控。miRNA對機體發育和代謝具有重要的調節作用[22-23]，是靶基因表達的關鍵調節因子[24]，參與調節骨骼肌細胞增殖[25-26]、分化[27-28]和再生[29]，一些miRNA調節成脂基因的表達、脂肪的形成[30]和分化[31]、白色脂肪棕色化[32]以及棕色脂肪擴張[33]。據研究報道，miR-22-5p是脂肪來源間充質干細胞的的重要參考基因[34]，還在骨溶解中發揮重要作用[35]。因而，進一步推測ssc-miR-22-5p可能通過靶向CA5B參與調節豬的體內發育和代謝。最后，本研究分析發現了CA5B基因的3個A-to-G編輯位點。RNA編輯位點可能參與調節基因表達和細胞功能[36]、骨骼肌發育[19]、疾病發生[37]和腫瘤的發展[38]，可能對豬基因的表達進行調控。

豬是重要的家畜，為我們的生活提供大量的蛋白質和脂肪。因此，研究分析參與調節豬糖代謝和脂肪生成的CA5B基因對于肉品質的改良有一定的參考作用。但是，現在對豬CA5B的研究較少，因此需要對該基因進行深入的挖掘以及功能驗證。

4 結 論

本研究初步探討了CA5B基因在10個物種間的保守性和進化特征，CA5B蛋白可能參與細胞內線粒體內外ATP的合成、物質轉運以及體內氨基酸的分解代謝。ssc-miR-22-5p和3個RNA編輯位點潛在參與調控CA5B基因表達。CA5B可能在豬胚胎期的發育過程中發揮重要功能，在豬出生后能量儲存和利用的組織中有關鍵作用。以上結果為更深入研究豬CA5B的功能提供了重要的信息和奠定了基礎。

致謝

感謝北京畜牧獸醫研究所豬基因工程與種質創新團隊提供的科研平臺，感謝實驗室師兄、師姐、師弟、師妹在樣品采集和數據分析時提供的幫助和支持，感謝團隊所有人員的照顧和幫助。