鹽酸阿考替胺相關雜質的合成及結構確證

尤洪坤，奚 旺，周 力，鄒巧根

(南京工業大學 藥學院，江蘇 南京 211800)

鹽酸阿考替胺，商品名為Acofide，由澤里新藥株式會社開發和研究，于2013年6月獲批在日本上市，被用于治療功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)引起的餐后飽脹、上腹脹、早飽等癥狀[1]。研究顯示：在長期持續給藥的條件下，鹽酸阿考替胺仍然具有很高的安全性[2-3]，間斷給藥仍然對FD具有良好的治療效果[4]。

已經報道的鹽酸阿考替胺合成路線[5-9]中存在使用試劑昂貴，生產過程環境污染大，產品純度低，精制純化方法復雜，操作困難及產率低等問題。長澤正明等[10-11]以2,4,5-三甲氧基苯甲酸為起始原料，經氯化亞砜酰化后，與2-氨基-4-乙氧羰基-1,3-噻唑縮合，得到2-[N-(2,4,5-三甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-乙氧基羰基-1,3-噻唑(AKTA-1)，AKTA-1與二正丁胺反應脫甲基，得到2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羥基苯甲酰基)氨基]-4-乙氧基羰基-1,3-噻唑(AKTA-2)，AKTA-2再與二異丙基乙二胺縮合，得到2-[N-(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)氨基]-4-[(2-二異丙基氨基乙基氨基羰基)]-1,3-噻唑(AKTA-3)，AKTA-3經過成鹽和精制，得到鹽酸阿考替胺(AKTA)，最終產率可達57%，得到的鹽酸阿考替胺成品符合原料藥的質量要求。本工藝用到的起始物料和試劑便宜易得，反應條件溫和，操作簡單環保，適用于工業化大規模生產。

目前鹽酸阿考替胺雜質研究較少，戴德標等[12]開發了一種有關物質的分析方法，對6個雜質和鹽酸阿考替胺主成分進行了分離。曲繼廣等[13]對鹽酸阿考替胺7個雜質進行了定性、定量分析。Thummar等[14]利用高效液相色譜-電噴霧飛行時間串聯質譜儀(UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS)法對鹽酸阿考替胺的降解雜質進行了分離、鑒定和表征。寧金洋等[15]定向合成了兩種鹽酸阿考替胺雜質單體并對其進行表征。隨裕敏等[16]提供了一種鹽酸阿考替胺二聚體雜質的制備及其純度的檢測方法。

結合鹽酸阿考替胺藥物的研究現狀，本文主要研究內容為根據相關文獻報道，確定鹽酸阿考替胺的生產工藝路線，并根據合成工藝對5個雜質的產生路徑進行分析，最后對鹽酸阿考替胺的5個雜質進行合成和結構確證。鹽酸阿考替胺的合成路線如圖1所示。

圖1 鹽酸阿考替胺合成路線Fig.1 The synthesis route of acotamine hydrochloridl

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Mircomass Q-TOF micro型質譜儀，美國Waters公司；Avance 300型核磁共振光譜儀，德國Bruker公司。

2,4,5-三甲氧基苯甲酸(SMA)、2-氨基-4-乙氧基羰基-1,3-噻唑(SMB)，工業級，上海邦成化工有限公司；N,N-二異丙基乙二胺(SMC，工業級)，上海卓銳化工有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雜質Ⅰ的合成

100 mL的三口瓶攪拌下，依次加入3.66 g(10 mmol)AKTA-1和30.0 mL甲苯，加熱至回流。滴加5.77 g SMC(40 mmol)，回流反應6 h，薄層色譜法(TLC)監控AKTA-1反應完全(展開劑體積比二氯甲烷與甲醇為20∶ 1)。反應結束，降至室溫，加入30.0 mL飽和食鹽水洗滌1次，分液，留取上層有機相，減壓濃縮得深色油狀物。濃縮物溶于30.0 mL乙醇中，滴加濃HCl調pH至1～2，減壓濃縮得淡黃色固體。將所得固體用20.0 mL丙酮打漿一次，過濾得白色固體。將所得固體真空干燥(0.1 MPa，40℃)過夜，得3.50 g產物，收率為75.42%，合成路線見圖2。

圖2 雜質Ⅰ合成路線Fig.2 The synthesis route of impurity Ⅰ

1.2.2 雜質Ⅱ的合成

在250 mL的三口瓶中,依次加入5.30 g AKTA-2(15 mmol)、乙醇100 mL和NaOH 25 mL(1.60 g，40 mmol)水溶液攪拌。加熱至50 ℃，保溫反應2 h，TLC監控AKTA-2反應完全(展開劑體積比二氯甲烷與甲醇為20∶ 1)。反應結束，降至室溫，用稀HCl調pH至2～3，有固體析出，過濾，水洗，得白色固體。將所得固體真空干燥(0.1 MPa，45 ℃)過夜，得3.10 g產物，收率為95.60%，合成路線見圖3。

圖3 雜質Ⅱ合成路線Fig.3 The synthesis route of impurity Ⅱ

1.2.3 雜質Ⅲ的合成

在50 mL的單口瓶中,依次加入3.44 g SMB(20 mmol)和11.38 g SMC(80 mmol)攪拌，油浴加熱至140 ℃，保溫反應2 h，TLC監控SMB反應完全(展開劑體積比二氯甲烷與甲醇為10∶ 1)。反應結束，降至室溫，得黃色油狀物。加乙醇溶解，用稀HCl調pH至2～3，減壓濃縮，濃縮物加入甲苯溶解，再次濃縮，得黃色固體。所得固體用甲醇打漿1次，將所得固體真空干燥(0.1 MPa，40 ℃)過夜，得3.80 g產物，收率為70.30%，合成路線見圖4。

圖4 雜質Ⅲ合成路線Fig.4 The synthesis route of impurity Ⅲ

1.2.4 雜質Ⅳ的合成

在50 mL的單口瓶中,依次加入3.52 g(10 mmol)AKTA-2和20 mL甲苯攪拌，加熱至回流，滴加4.40 g(43 mmol)N-異丙基乙二胺，回流反應6 h，TLC監控AKTA-2反應完全(展開劑體積比二氯甲烷與甲醇為20∶ 1)。反應結束，降至室溫，攪拌下加入10 mL飽和NaCl水溶液。過濾，水洗，二氯甲烷洗滌，抽干，得黃色固體。將固體加入到10 mL異丙醇中，加熱溶解，滴加濃HCl調pH至1～2，降溫，有白色固體析出，過濾，異丙醇洗滌，得白色固體。將所得固體真空干燥(0.1 MPa，45℃)，過夜，得3.40 g產物，收率為83.20%，合成路線見圖5。

圖5 雜質Ⅳ合成路線Fig.5 The synthesis route of impurity Ⅳ

1.2.5 雜質Ⅴ的合成

250 mL的三口瓶攪拌下,依次加入6.12 g AKTA-2(17 mmol)和甲苯44 mL，加熱至110 ℃，滴加9.0 g乙二胺(150 mmol)，回流反應4 h，TLC監控AKTA-2反應完全(展開劑體積比二氯甲烷與甲醇為20∶ 1)。反應結束，降至室溫，靜置，傾倒出上層淡黃色甲苯層，下層棕色油狀物中加入44 mL甲苯洗滌1次，分出甲苯層。油狀物中加入44 mL甲醇攪拌全溶，室溫滴加3.43 g HCl，有固體析出，攪拌0.5 h后抽濾得黃色固體。將所得固體鼓風干燥(45℃)，過夜，得5.31 g產物，收率為75.80%，合成路線見圖6。

圖6 雜質Ⅴ合成路線Fig.6 The synthesis route of impurity Ⅴ

2 結果與討論

2.1 雜質來源分析

根據合成工藝路線，結合起始物料和成品的檢測情況，對鹽酸阿考替胺成品中可能存在的有機雜質進行推測，從起始物料與中間體殘留、工藝副產物和降解雜質3個方面對雜質的結構、來源進行分析。雜質Ⅰ為鹽酸阿考替胺合成工藝中的副產物，由AKTA-1殘留在第三步與SMC縮合反應生成；雜質Ⅱ為合成工藝中的副產物，有兩種可能產生途徑，分別為AKTA-1直接脫甲基并發生酯基水解產生，或者由AKTA-2酯基水解產生；雜質Ⅲ為合成工藝中的副產物和降解產物，由殘留的SMB與SMC反應產生或成品降解產生；雜質Ⅳ為合成工藝中的副產物，由SMC引入的雜質與AKTA-2反應產生，或者由AKTA-3在成鹽一步中高溫下脫異丙基產生；雜質Ⅴ為合成工藝中的副產物，由SMC引入的雜質與AKTA-2反應產生，路徑分析見圖7。

圖7 工藝雜質產生來源路徑分析Fig.7 The routes for the source of the process impurities

2.2 雜質結構確證

2.2.1 雜質Ⅰ的結構確證

質譜解析：正離子模式下質荷比465.2的峰為基峰，根據分子量推測為[M+H]+峰，質荷比466.2、467.2的峰推測為同位素峰；負離子模式下質荷比463.2的峰為基峰，根據分子量推測為[M-H]-峰，質荷比464.2、465.2的峰推測為同位素峰，說明樣品分子量為464，與雜質Ⅰ的分子量464.58一致。

1H-NMR解析：δ2.50為d6-DMSO溶劑峰，δ4.25為水峰，δ11.32(s，1H，H-11)，δ10.06(s，1H，H-16)，δ8.71(s，1H，H-25)，δ7.89(s，1H，H-13)，δ7.50(s，1H，H-6)，δ6.59(s，1H，H-3)，δ4.08(s，3H，H-9)，δ3.92(s，3H，H-8)，δ3.78(s，3H，H-7)，δ3.66～3.62(m，J=6.06 Hz；J=5.61 Hz，4H，H-17、H-19、H-22)，δ3.16(s，2H，H-18)，δ1.36～1.30(m，12H，H-20、H-21、H-23、H-24)。

13C-NMR解析：δ39.83～39.17為d6-DMSO溶劑峰，δ162.59(C-10)，δ161.01(C-15)，δ157.24(C-12)，δ154.04(C-4)，δ153.45(C-2)，δ144.09(C-14)，δ143.11(C-5)，δ118.46(C-13)，δ113.00(C-6)，δ109.61(C-1)，δ97.97(C-3)，δ57.29(C-9)，δ56.13(C-8)，δ55.93(C-7)，δ54.54(C-19、C-22)，δ45.85(C-18)，δ36.54(C-17)，δ17.96(C-23、C-24)，δ16.10(C-20、C-21)。

2.2.2 雜質Ⅱ的結構確證

質譜解析：正離子模式下質荷比325.0的峰為基峰，根據分子量推測為[M+H]+峰，質荷比347.0的峰推測為[M+Na]+峰，說明樣品分子量為324，與雜質Ⅱ的分子量324.31一致。

1H-NMR解析：δ2.50為d6-DMSO溶劑峰，δ12.09(s，2H，H-9、H-11)，δ8.02(s，1H，H-13)，δ7.58(s，1H，H-6)，δ6.70(s，1H，H-3)，δ3.97～3.93(d，J=12.60 Hz，3H，H-8)，δ3.80～3.76(d，J=12.06 Hz，3H，H-7)。

13C-NMR解析：δ40.31～38.64為d6-DMSO溶劑峰，δ165.51(C-10)，δ162.24(C-15)，δ157.83(C-12)，δ155.02(C-4)，δ154.61(C-2)，δ142.28(C-5，C-14)，δ122.80(C-13)，δ110.84(C-6)，δ105.55(C-1)，δ100.80(C-3)，δ55.98(C-8)，δ55.74(C-7)。

2.2.3 雜質Ⅲ的結構確證

質譜解析：正離子模式下質荷比271.2的峰為基峰，根據分子量推測為[M+H]+峰，質荷比272.2的峰推測為同位素峰，說明樣品分子量為270，與雜質Ⅲ的分子量270.39一致。

1H-NMR解析：δ2.49為d6-DMSO溶劑峰，δ10.13(s，1H，H-6)，δ9.17(s，1H，H-4)，δ8.61(s，1H，H-4)，δ7.65(s，1H，H-3)，δ6.40(br，3H，HCl)，δ3.62(s，2H，H-7、H-8)，δ3.15(s，2H，H-9、H-12)，δ1.35～1.28(m，4-H，H-10、H-11、H-13、H-14)。

13C-NMR解析：δ40.33～38.67為d6-DMSO溶劑峰，δ169.06(C-5)，δ158.40(C-1)，δ137.16(C-2)，δ111.98(C-3)，δ54.49(C-9)，δ45.56(C-12)，δ48.13(C-8)，δ36.44(C-7)，δ17.98(C-10、C-11)，δ16.13(C-13、C-14)。

2.2.4 雜質Ⅳ的結構確證

質譜解析：正離子模式下質荷比409.1的峰為基峰，根據分子量推測為[M+H]+峰，質荷比410.1的峰推測為同位素峰；負離子模式下質荷比407.1的峰為基峰，根據分子量推測為[M-H]-峰，質荷比408.1的峰推測為同位素峰，說明樣品分子量為408，與雜質Ⅳ的分子量408.47一致。

1H-NMR解析：δ2.44為d6-DMSO溶劑峰，δ4.87為水峰，δ11.71(br，1H，H-11)，δ9.00(s，2H，H-16、H-19)，δ8.65(s，1H，H-23)，δ7.84(s，1H，H-13)，δ7.41(s，1H，H-6)，δ6.95(s，1H，H-3)，δ3.72(s，6H，H-7、H-8)，δ3.54～3.52(m，2H，H-17)，δ3.26～3.22(m，1H，H-20)，δ2.99(m，2H，H-18)，δ1.19～1.17(d，6H，H-21、H-22)。

13C-NMR解析：δ40.32～38.66為d6-DMSO溶劑峰，δ163.61(C-10)，δ161.14(C-15)，δ157.57(C-12)，δ154.29(C-4)，δ153.43(C-2)，δ144.26(C-14)，δ142.49(C-5)，δ118.37(C-13)，δ111.72(C-6)，δ106.58(C-1)，δ100.98(C-3)，δ55.96(C-8)，δ55.75(C-7)，δ49.50(C-20)，δ43.30(C-18)，δ35.53(C-17)，δ18.49(C-21、C-22)。

2.2.5 雜質Ⅴ的結構確證

質譜解析：正離子模式下質荷比367.2的峰為基峰，根據分子量推測為[M+H]+峰，質荷比368.2的峰推測為同位素峰；負離子模式下365.1的峰為基峰，根據分子量推測為[M-H]-峰，質荷比366.1的峰推測為同位素峰，說明樣品分子量為366，與雜質Ⅴ扣除鹽酸鹽的分子量366.39一致。

1H-NMR解析：δ2.49為d6-DMSO溶劑峰，δ3.50為水峰，δ8.40(s，1H，H-9)，δ7.53(s，1H，H-13)，δ7.32(s，1H，H-6)，δ6.80(br，5H，H-11、H-16、H-19、H-20)，δ6.33(s，1H，H-3)，δ3.71～3.66(s，6H，H-7、H-8)，δ2.97(s，4H，H-17、H-18)，結果見圖8。

圖8 雜質Ⅴ的1H-NMR 圖Fig.8 The 1H-NMR spectrum of impurity Ⅴ

13C-NMR解析：δ39.923～38.821為d6-DMSO溶劑峰，δ168.106(C-10)，δ163.789(C-15)，δ162.281(C-12)，δ159.010(C-4)，δ153.087(C-2)，δ143.729(C-14)，δ139.972(C-5)，δ115.745(C-13)，δ111.844(C-6)，δ109.648(C-1)，δ101.186(C-3)，δ56.057(C-8)，δ55.259(C-7)，δ38.027(C-18)，δ36.627(C-17)，結果見圖9。

圖9 雜質Ⅴ的13C-NMR圖Fig.9 The 13C-NMR spectrum of impurity Ⅴ

3 結論

通過對鹽酸阿考替胺合成過程中產生的5個雜質進行定向合成，利用質譜及核磁技術對獲得的雜質結構進行解析，完成了對5個雜質的結構確證工作，確定雜質Ⅰ結構為2-[N-(4,5-二甲氧基-2-羥基苯甲酰基)氨基]-4-乙氧基羰基-1,3-噻唑鹽酸鹽，雜質Ⅱ結構為2-(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲酰胺)-噻唑-4-甲酸，雜質Ⅲ結構為2-氨基-N-(2-二異丙基氨基乙基)噻唑-4-甲酰胺，雜質Ⅳ結構為2-(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲酰胺)-N-(2-異丙基氨基乙基)噻唑-4-甲酰胺鹽酸鹽，雜質Ⅴ結構為2-(2-羥基-4,5-二甲氧基苯甲酰胺)-N-(2-氨基乙基)噻唑-4-甲酰胺鹽酸鹽。本文較全面地剖析了鹽酸阿考替胺原料藥中的雜質，對各雜質的來源和可能產生的路徑進行分析，以便于從合成工藝的源頭上對鹽酸阿考替胺進行質量控制，有助于產品質量的提高。