嘌呤核苷磷酸化酶與嘧啶核苷磷酸化酶的融合表達及酶法合成嘌呤核苷類產物

徐玲玲，康麗峰，劉高飛，何冰芳，儲建林

(1.南京工業大學 藥學院，江蘇 南京 211816; 2.常州市第一人民醫院，江蘇 常州 213003； 3.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816)

核苷類藥物是臨床上重要的抗病毒、抗腫瘤藥物[1-2]，主要有：齊多夫定、阿巴卡韋等可用于治療艾滋??；恩替卡韋、替比夫定等可用于治療乙肝病毒；克拉屈濱、氟達拉濱等可用于治療白血病、淋巴瘤等腫瘤疾病[3-5]。核苷類化合物以化學法合成報道居多，該方法是利用保護的堿基與多羥基選擇性保護的核糖進行縮合反應來制備核苷類產物，但得到的核苷產物往往是核糖(阿糖)α、β同分異構體產物；化學法也可以利用天然核苷類化合物為原料，對其堿基或核糖基進行修飾，得到其核苷類化合物的新型衍生物[6]。化學法合成核苷類產物往往需要多步反應，對活性基團修飾保護與脫保護，使用重金屬等特點，不利于環保[7]；甚至還需要對其異構體拆分，才能得到活性β型核苷類產物，糖異構體的化合物一般難以分離獲得高純度的單一異構體核苷產物，化學法合成核苷產物的最終產率往往不是很高[7-8]。

生物酶法合成核苷類藥物具有無需保護、步驟少、無糖異構體產物生成等特點與優勢[6-8]。目前，生物酶法催化合成核苷類藥物主要有核苷磷酸化酶和N-脫氧核糖轉移酶兩大類酶[8]。依據核苷磷酸化酶對嘌呤與嘧啶類底物的選擇性，可細分為嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶[9-10]。核苷磷酸化酶對糖供體選擇范圍較為寬泛，能識別核糖、脫氧核糖等多種核苷類糖供體，被用于核苷類產物的合成制備方面較為引人注目[9-10]。核苷磷酸化酶能以廉價的天然核苷為原料，可逆催化其磷酸化反應，生成1-磷酸核糖為真正的核糖基供體，以堿基為受體合成新的核苷類產物(即催化核苷與堿基之間的轉換反應)[8-10]。嘌呤核苷磷酸化酶往往只能催化嘌呤核苷供體的磷酸化反應，并只能合成嘌呤核苷產物，對嘧啶類堿基供體不反應，具有極為嚴格的堿基底物受體專一性(嘧啶核苷磷酸化酶類同)[11]。

生物酶法合成嘌呤核苷類產物，利用嘌呤核苷磷酸化酶與嘧啶核苷磷酸化酶構建的雙酶催化體系來合成嘌呤核苷產物，能得到較高的產率[12-13]。該雙酶催化的具體反應過程：第一步由嘧啶核苷磷酸化酶催化嘧啶核苷的磷酸化反應水解生成1-磷酸核糖(作為第二個酶的糖供體)，第二步再由嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌呤堿基與1-磷酸核糖的合成反應從而得到嘌呤核苷類產物[14]。嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶在熱動力學方面分別偏向于水解合成，雙酶催化有利于嘌呤核苷類產物的合成累積；并且第一步反應所產生的嘧啶堿基副產物不會參與第二步反應，不會因為副產物的積累而抑制第二步反應，最終提高了嘌呤核苷類產物的合成產率[12-15]。

然而，單獨添加的游離雙酶的生物催化是在液體反應體系下進行的，中間產物可能很容易擴散，且局部濃度不高、傳質效率較低，導致中間產物不易很快進入第二個酶的活性中心參與反應[14]。因此，考慮利用連接肽將第一個酶與第二酶相互連接在一起，形成新的融合蛋白[16-17]。連接肽特性如連接肽長度、剛柔性等可能影響酶的表達與酶的活性[18-21]，合適的連接肽可增強酶與酶分子之間的臨近效應，可能會形成較強的底物通道效應，顯著提高參與反應物質的傳質效率，并減少中間物的擴散，從而大幅度地提高反應效率[22-23]。

本文利用自行篩選，并實現表達的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP為研究對象，酶EcUP和酶AmPNP具有相對較小的分子量，具有相似的三維結構；酶EcUP和酶AmPNP適合進行雙酶融合的表達研究。對尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP進行融合設計；考察不同特性的連接肽(Linker)對酶融合的可溶性表達影響，并研究了融合效果最好的融合蛋白催化合成克拉曲濱等嘌呤核苷類產物的影響，以期實現雙酶高效催化合成核苷產物，增強生物催化合成核苷的實用性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株E.coli和菌株AneurinibacillusmigulanusAM007，由南京工業大學藥學院何冰芳教授的研究室篩選并保存，其中菌株AneurinibacillusmigulanusAM007在中國典型培養物保藏中心的編號為CCTCC NO.M2016404[24]；E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α化學感受態細胞，南京市諾唯贊公司；質粒pET-28a(+)，北京市索萊寶公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒、限制性內切酶NdeⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、Prime STAR HS DNA聚合酶、DNA Marker等，北京市TaKaRa公司；2×EVO Master Mix，南京市諾唯贊公司；質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司。HPLC分析使用的溶劑甲醇為色譜級；尿苷，脫氧尿苷，核苷堿基等其他試劑均為分析純試劑。

工程菌株的液體培養基(LB培養基)： NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，上述培養基于121 ℃滅菌 20 min，加入過濾除菌的硫酸卡那霉素(Kana)使其終質量濃度為50 mg/L，制得液體培養基。工程菌株的平板固體培養基：在上述的液體培養基中額外添加瓊脂粉20 g/L，相同條件滅菌，加入過濾除菌的Kana使其終質量濃度為50 mg/L，制得平板固體培養基。

所用的相關引物見表1。

表1 核苷磷酸化酶EcUP與AmPNP的基因克隆與酶融合設計的引物序列Table 1 Primer sequences of purine nucleoside phosphorylase EcUP,pyrimidine nucleoside phosphorylase AmPNP and fusion enzymes

1.2 實驗方法

1.2.1 嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因的克隆

分別提取本研究室自行篩選獲得的菌株AneurinibacillusmigulanusAM007與大腸桿菌(E.coli)的總DNA基因組，以對應菌株的總DNA為模板，分別進行酶AmPNP與酶EcUP的基因擴增。PCR基因擴增的反應體系為2×EVO Master Mix 25 μL，分別加入2 μL對應的引物E1/E2與A1/A2，DNA模板2 μL和超純水19 μL。PCR擴增反應條件：1) 94 ℃，預變性3 min；2) 94 ℃，變性15 s；3) 55 ℃，退火30 s；4) 72 ℃，延伸1 min； 2)～4)步驟循環重復30次；5) 72 ℃徹底延伸10 min，冷卻至4 ℃。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因的DNA片段，獲得嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP與嘧啶核苷磷酸化酶EcUP的基因序列。

1.2.2 融合蛋白EcUP-Linker-AmPNP的重組菌構建與誘導表達

分別以酶AmPNP和酶EcUP基因序列為模板，進行基因擴增。以酶EcUP基因為模板，雙酶融合設計使用的引物分別為E-S-N/E-X-L1，E-S-N/E-X-L2，E-S-N/E-X-L3，E-S-N/E-X-L4；以酶AmPNP基因為模板，融合設計使用的引物分別為A-X-B/A-S-L1，A-X-B/A-S-L2，A-X-B/A-S-L3，A-X-B/A-S-L4，基因擴增反應體系與方法同上一步。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因片段。獲得目的基因片段ELn和ALn(n=1、2、3、4)。以基因片段ELn(n=1～4)和 ALn(n=1～4)為模板，以引物E-S-N和A-X-B進行重疊PCR反應，連接肽將酶EcUP的C端連接到酶AmPNP的N端，重疊PCR擴增反應條件同上。純化后的基因片段與pET-28a(+)質粒，加入NdeI和BamHI限制性內切酶，于37 ℃反應6 h，純化后得到酶融合蛋白的基因片段產物，再用T4 DNA連接酶16 ℃下連接12 h后轉入E.coliBL21(DE3)化學感受態細胞。菌落PCR驗證陽性克隆子，樣品送至南京思普金生物科技有限公司進行測序，獲得對應的重組雙酶融合蛋白的工程菌株。

采用優化后的誘導表達條件進行重組雙酶融合蛋白的誘導表達：將獲得的重組菌接種至終質量濃度為50 μg/mL的Kana液體培養基中，于37 ℃，200 r/min條件下培養12 h作為種子液。種子液按體積分數1%接種到上述培養基中相同條件培養2 h左右(OD600約為0.6)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導培養溫度為20 ℃，誘導培養8 h后于4 ℃，8 000 r/min離心20 min收集菌體，用等體積pH 8.0 Na2HPO4-KH2PO4(PBS)緩沖液50 mmol/L懸浮菌體，菌體細胞超聲破碎10 min后，于4 ℃，12 000 r/min離心20 min獲得酶上清液并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.3 核苷磷酸化酶及融合酶的酶活力與水解產率的測定

利用HPLC法測定核苷磷酸化酶的活力[15]。核苷磷酸化酶AmPNP的酶學性質，如最適反應溫度、pH等條件，參照參考文獻[24]。核苷磷酸化酶EcUP的序列與已有的文獻報道一致，該酶的酶學性質參照參考文獻[25]。核苷磷酸化酶與酶融合蛋白的活力測定方法如下：用pH 8.0、50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，其中含1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)分別配制含有40.0 mmol/L的肌苷、尿苷、鳥苷、腺苷和脫氧尿苷的底物溶液。酶活力測定時，反應體系中分別加入250 μL上述底物溶液和700 μL上述PBS緩沖液，最后加入50 μL稀釋適當倍數的酶液(在酶的C端加入了6×His，利用鎳柱親和層析的方法純化獲得的純酶)，于50 ℃條件下反應10 min，取樣50 μL立即加入到950 μL甲醇中，終止反應，檢測計算各樣品中生成產物的量。1個單位(U)核苷磷酸化酶或融合酶的酶活力定義為在上述最適的反應條件下，每分鐘催化磷酸化反應消耗1 μmol的核苷底物所需的酶量。

1.2.4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應條件

嘌呤核苷合成的反應條件參照參考文獻[24]，以pH 8.0的PBS緩沖液(含1 mmol/L的EDTA)配制10 mmol/L的尿苷或脫氧尿苷(核苷糖供體)，5 mmol/L的各種嘌呤類堿基(堿基受體)；加入合適濃度的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的融合酶(在酶的C端加入了6×His，鎳柱親和層析的方法純化獲得了其純酶)，在恒溫振蕩反應器中50 ℃反應，進行嘌呤核苷產物的合成。反應一定時間后，取50 μL樣品立即加入950 μL甲醇終止反應。樣品預處理后，采用HPLC檢測相應的產物[14-15]，檢測分析條件：Discovery C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，進樣量10 μL，流動相V(甲醇)∶V(純水)=1∶ 9，波長為254 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min。

2 結果與討論

2.1 嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因的獲取

以菌株AneurinibacillusmigulanusAM007總DNA基因組為模板，利用相應的引物，PCR擴增獲得了編碼嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的基因，電泳條帶大小與預期的嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP基因長度相符(圖1)，并進行測序，驗證了其大小為813 bp。以大腸桿菌(E.coli) 的總DNA基因組為模板，利用相應的引物，PCR擴增獲得嘧啶核苷磷酸化酶EcUP的基因，電泳分析表明：嘧啶核苷磷酸化酶EcUP基因長度與預期相符(圖1)并進行測序,驗證了其大小為762 bp。

M—Marker；PNP—嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的基因產物；EcUP—嘧啶核苷磷酸化酶EcUP基因產物圖1 嘌呤核苷磷酸化酶基因與嘧啶核苷磷酸化酶基因PCR的擴增產物Fig.1 PCR amplification product of purine nucleosidephosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase gene

2.2 核苷磷酸化酶的融合表達菌株構建與融合蛋白的表達量影響

嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP(編碼270個氨基酸)與嘧啶核苷磷酸化酶EcUP(編碼253個氨基酸)可分別在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中實現高效表達。嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP在GenBank中的登記號為MH992394，嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP的氨基酸列在本文研究申請的發明專利中也有詳細記載[24]，嘧啶核苷磷酸化酶EcUP在GenBank中的登記號為QBF93483。

選用不同特性的典型剛性/柔性連接肽，分別構建了EcUP與AmPNP的4種融合蛋白的重組菌，考察了連接短肽對雙酶融合表達的影響，雙酶融合蛋白的表達情況見圖2。如圖2所示：SDS-PAGE分析表明，嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP融合表達后，在分子量6.3×104處有明顯的蛋白條帶，與預期融合蛋白的理論分子量大小相符。4種融合蛋白EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP-L3-AmPNP，EcUP-L4-AmPNP均可以實現異源表達；但不同連接肽獲得的融合蛋白的可溶性表達水平差異較大。以柔性連接肽L1、L2、L3構建獲得的融合蛋白表達以包涵體為主，僅有少部分的可溶性蛋白。使用剛性連接短肽L4 (EEEEEEKKK)構建獲得的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP的可溶性部分比較多，包涵體部分的量極少?？梢娒窤mPNP與酶EcUP融合時，剛性連接肽對其融合蛋白的可溶性表達有利，可實現融合蛋白的正確折疊，能形成具有較高酶活性的雙酶融合體。

M—蛋白Marker；1—EcUP-L1-AmPNP的破碎上清；2—EcUP-L1-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；3—EcUP-L2-AmPNP的破碎上清；4—EcUP-L2-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；5—EcUP-L3-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)；6—EcUP-L3-AmPNP的破碎上清；7—EcUP-L4-AmPNP的破碎上清；8—EcUP-L4-AmPNP的破碎沉淀(包涵體)圖2 不同連接肽對核苷磷酸化酶融合蛋白表達影響的SDS-PAGE分析圖Fig.2 Effect of different linker on the recombinant fusion protein of purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside phosphorylase by SDS-PAGE analysis

2.3 融合酶EcUP-Linker-AmPNP的活性及其對核苷底物的水解產率影響

筆者克隆表達獲得的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP只能水解嘧啶核苷類底物，不能水解嘌呤核苷類底物；嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP只能水解嘌呤核苷類底物，但不能水解嘧啶核苷類底物。這兩個酶對核苷類底物的反應性能情況與一些現有的報道相似[9]。通過雙酶的融合表達可能實現融合酶對多種類核苷底物的反應活性。筆者分別測試分析了4種雙酶融合體EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP- L3-AmPNP，EcUP-L4-AmPNP對幾種核苷類底物的反應情況。結果表明：以包涵體較多的融合酶EcUP-L1-AmPNP，EcUP-L2-AmPNP，EcUP-L3-AmPNP可溶性蛋白與包涵體部分均沒有反應活性或極低的反應活性。在大腸桿菌中能大部分可溶性表達的融合酶EcUP-L4-AmPNP具有較高的活性。核苷磷酸化酶的融合體EcPNP-L4-AmUP對尿苷、肌苷等核苷類底物的酶活力情況(表2)。由表2可知：融合酶EcUP-L4-AmPNP對嘌呤和嘧啶核苷類底物的水解比活力大小順序為尿苷、肌苷、脫氧尿苷、鳥苷、腺苷；融合酶EcUP-L4-AmPNP對嘌呤和嘧啶核苷類底物的水解產率的大小依次為脫氧尿苷、尿苷、肌苷、腺苷、鳥苷。從反應熱力學方面來看：酶融合蛋白EcUP-L4-AmPNP對嘧啶核苷的水解產率都大于嘌呤核苷，這可能是融合酶EcUP-L4-AmPNP中的嘧啶核苷磷酸化酶EcUP催化嘧啶類核苷的水解反應活性相對比較高，而嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP催化磷酸化反應合成嘌呤核苷活性相對比較高導致的。利用連接肽將嘧啶核苷磷酸化酶EcUP和嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP相互融合，并成功地實現了可溶性表達；獲得了對嘌呤和嘧啶類底物均有活性的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP，拓展了其可催化反應的核苷類底物類型，該融合蛋白可能適用于生物催化合成嘌呤核苷類產物。

表2 雙酶融合蛋白EcPNP-L4-AmUP的水解嘌呤核苷類與嘧啶核苷類底物的活力情況與水解產率Table 2 The phosphorolysis reaction activity and hydrolyzing yield of fusion enzyme EcPNP-L4-AmUP towards purine nucleosides and pyrimidine nucleosides

2.4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應進程曲線

游離雙酶催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的反應優化后，其反應條件為50 mmol/L、pH 8.0磷酸緩沖(含1 mmol/L EDTA)，反應溫度為50 ℃，核苷糖供體為嘧啶類尿苷(10 mmol/L)，嘌呤堿基受體為2,6-二氨基嘌呤(5 mmol/L)。反應體系中分別加入游離的尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP(摩爾比為1∶ 1混合)，該條件下游離雙酶催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的最高產率約63.0%(圖3)。利用雙酶融合體EcUP-L4-AmPNP為生物催化劑，研究其催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的反應進程曲線，雙酶融合體EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的情況(HPLC分析圖譜見圖4)，產物經與2,6-二氨基嘌呤核苷標準品比較，并進行質譜分析確證。測定了融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的反應進程曲線(圖3)。由圖3可知：當反應達到60 h時，融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的反應趨于平緩，產率最高可以達到98.4%。已有報道利用來源于AeropyrumpernixK1的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶合成2,6-二氨基嘌呤核苷的產率大約為60.0%[14]。Zhou等[15]使用來源于Thermusthermophilus的核苷磷酸化酶(PNP)和來源于Geobacillusthermoglucosidasius的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNP)“一鍋法”合成2,6-二氨基嘌呤核苷的產率可以達到95.3%(底物濃度及比例為尿苷∶ 2,6-二氨基嘌呤為2∶ 1)。本研究獲得的融合酶EcUP-L4-AmPNP合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的產率高于現有的一些文獻報道，并且合成嘌呤核苷的反應底物濃度水平顯著高于目前已有的報道。推測可能是融合蛋白中AmPNP與EcUP微觀空間上的距離更加接近，形成了一定的底物通道效應，可能有利于增加在溶液中的中間體產物的局部濃度，提高中間體物質的傳質效率，從而提高了其催化合成嘌呤核苷類產物的產率。

圖3 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷的反應進程曲線Fig.3 Time course of purine nucleoside synthesized reaction catalyzed by fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

圖4 融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的HPLC分析圖Fig.4 HPLC analysis of purine nucleoside product catalyzed by fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

2.5 融合酶EcUP-L4-AmPNP高效生物催化合成的嘌呤核苷類產物

融合酶EcUP-L4-AmPNP對尿苷、脫氧尿苷(嘧啶類核苷)具有較高的水解活性，結果見表2。由表2可知：融合酶EcUP-L4-AmPNP也可以利用較為廉價的尿苷、脫氧尿苷(嘧啶類核苷)為糖供體，以嘌呤堿基為受體合成嘌呤核苷類產物。游離雙酶(將酶AmPNP與酶EcUP按1∶ 1的比例添加到反應體系中)與融合酶EcUP-L4-AmPNP均能催化合成幾種嘌呤核苷類產物(嘌呤核苷產物的編號分別為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4，具體見圖5)。研究比較了游離雙酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成多種嘌呤核苷類產物的產率情況(圖6)。

圖5 尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP雙酶法催化合成嘌呤核苷類產物(A1～B4)的反應示意圖Fig.5 Dual enzyme catalyzed the reaction of purine nucleosides biosynthesis by purine nucleoside phosphorylase EcUP and pyrimidine nucleoside phosphorylase AmPNP,products (A1-B4)

以尿苷為核苷糖供體，反應體系中分別加入游離雙酶(尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP，比例為1∶ 1)催化合成幾種嘌呤核苷類產物的產率在47%～63%；而使用融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成嘌呤核苷類產物的產率在85.6%～98.3%(圖6)。在嘌呤核苷產物的合成產率方面，融合酶EcUP-L4-AmPNP比游離雙酶提高了約1.5～1.8倍。以2′脫氧尿苷為核苷糖供體，反應體系中分別加入游離雙酶(尿嘧啶核苷磷酸化酶EcUP與嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP，比例1∶ 1)催化合成幾種2′脫氧嘌呤核苷類產物的產率在33.7%～60.5%(圖6)；而使用融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2′脫氧嘌呤核苷類產物的產率為70.4%～96.5%。在2′脫氧嘌呤核苷產物的合成產率方面，融合酶EcUP-L4-AmPNP比游離雙酶提高了約1.6～2.0倍。游離雙酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP均能合成抗白血病作用的克拉屈濱核苷類產物，融合酶EcUP-L4-AmPNP合成克拉屈濱的產率較高，可達70.4%(圖6)?？赡苁怯捎陔p酶融合表達，酶與酶分子之間產生了一定臨近效應，形成了底物通道效應，從而提高了其催化合成嘌呤核苷產物的產率[16]。

圖6 雙酶游離酶與融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成幾種嘌呤核苷類產物的比較Fig.6 Biosynthesizing yield of several purine nucleoside products by free dual enzyme and fusion enzyme EcUP-L4-AmPNP

3 結論

本研究設計了不同的連接肽(Linker)將E.coli來源的嘧啶核苷磷酸化酶EcUP和AneurinibacillusmigulanusAM007來源的嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP進行融合表達。不同特性(剛性、柔性)的連接肽對這兩個酶融合時的可溶性表達有著較大影響，使用剛性短肽連接起來的融合酶EcUP-L4-AmPNP可溶性表達水平較高，并實現了其對嘧啶類和嘌呤類核苷底物均具有的水解活性，且嘌呤核苷的水解率遠小于嘧啶核苷，有利于融合酶高效催化合成嘌呤核苷產物。相較于分別添加酶EcUP和酶AmPNP的游離雙酶反應體系，利用融合酶EcUP-L4-AmPNP作為生物催化劑合成2,6-二氨基嘌呤核苷、克拉屈濱等嘌呤核苷類產物的產率顯著提高，融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2,6-二氨基嘌呤核苷產物的產率最高可以達到98.4%，融合酶EcUP-L4-AmPNP合成克拉屈濱的產率可達70.4%。融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成嘌呤核苷類產物的產率可達85.6%～98.3%，比分別加入酶EcUP和AmPNP的游離雙酶體系提高了約1.5～1.8倍。融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成2′脫氧嘌呤核苷類產物的產率為70.4%～96.5%，比分別加入酶EcUP和AmPNP的雙酶游離酶體系提高了約1.6～2.0倍，可能是酶EcUP與酶AmPNP融合后在微觀空間上更加接近，酶分子之間可能形成了底物通道效應，從而使得嘌呤核苷產物的合成產率提高。雙酶的融合表達設計有助于實現雙酶的高效協同催化，對于雙酶催化反應的優化設計具有重要的意義。