土鱉蟲水溶性成分與脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

王 晶，陳心怡，鄧玉瑩，王慧慧，謝雪晴，王春梅

(北京中醫藥大學 生命科學學院,北京 100029)

土鱉蟲[1]為鱉蠊科昆蟲地鱉(EupolyphagasinensisWalker)或冀地鱉(Steleophagaplancyi(Boleny))的雌蟲干燥體[2]，味咸性寒，有小毒，歸肝經，具有破血逐瘀、續筋接骨之功效。土鱉蟲用于治療骨折具有悠久的歷史，最早記載于《神農本草經》。我國2015年版藥典[1]中含有土鱉蟲的處方共有29份，其中14份處方用于治療跌打損傷，且藥效顯著。程爵棠先生編寫的《蟲蛇妙方》[3]中記載，土鱉蟲用于治療骨折的驗方，治愈率均在70%以上，由此可見土鱉蟲治療骨折愈合臨床療效明確。土鱉蟲通過對骨生長因子的調控、改善血液循環、提高成骨細胞活性等加速骨折愈合?，F代研究表明，土鱉蟲中含有蛋白質、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、生物堿和脂溶性維生素等多種化學成分[4]。但是關于土鱉蟲促進骨折愈合的有效成分尚不清楚，MC3T3-E1成骨細胞系是作為體外研究成骨細胞模型的成熟細胞模型[5]，因此，筆者采用多種提取方式獲得土鱉蟲成分，研究其對促進MC3T3-E1成骨細胞增殖活性成分的溶解性及對溫度的敏感性，為后續繼續深入研究土鱉蟲促骨折愈合的活性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

土鱉蟲購自安徽亳州藥材市場，經北京中醫藥大學中藥鑒定系楊瑤君教授鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphagasinensis的雌蟲干燥體。

1.1.2 細胞

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞 MC3T3-E1，由中國科學院過程工程研究所生化實驗室張貴峰研究員饋贈，常規培養于含10%胎牛血清的MEM培養基中，置培養箱于5%CO2、37 ℃濕化條件下培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.3 試劑

噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，美國 Sigma公司；HyClone胎牛血清和MEM培養基，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；胰酶，美國Amresco公司；石油醚、乙酸乙酯，北京虹湖聯合化工產品有限公司；無水乙醇、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，北京化工廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1)土鱉蟲不同溫度水提物的制備。稱取60 g土鱉蟲粉(過0.425 mm篩)與300 mL純水混合均勻后放入-80 ℃冰箱反復凍融5次。第5次解凍后分成3組，分別在25(室溫、磁力攪拌)、50和90 ℃水浴條件下過夜，在8 000 r/min離心20 min后，上清液在真空冷凍干燥機中凍干，得到不同溫度的水提物。

2)土鱉蟲脂溶性成分的制備。采用索氏提取法獲得脂溶性產物。參照文獻[6]方法，稱取土鱉蟲粉5 g(過0.425 mm篩)，全部移入濾紙筒內，將濾紙筒放入脂肪抽提器內，由抽提器抽提冷凝管上端加入石油醚、乙酸乙酯于水浴上加熱，使石油醚、乙酸乙酯回流提取6 h后取下接受瓶，回收石油醚、乙酸乙酯，待接受瓶內石油醚、乙酸乙酯剩1～2 mL時在水浴上蒸干后，放入干燥器內干燥冷卻1 h再稱質量，產物即為土鱉蟲石油醚提取物和土鱉蟲乙酸乙酯提取物。

3)土鱉蟲的25 ℃水提物在不同溫度不同時間下二次水提物的制備。取適量土鱉蟲25 ℃未凍干水提物，分成5份再分別在25、37、50、75和100 ℃條件下水浴4 h，在真空冷凍干燥機中凍干，得到不同溫度二次水提物；另取土鱉蟲25 ℃未凍干水提物，在50 ℃水浴條件下再分別水浴4、6、8、10和12 h，在真空冷凍干燥機中凍干，得到不同時間的二次水提物。

1.2.2 MTT法檢測水溶性成分對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

參照文獻[7]方法，將實驗設置為陰性對照組(MEM培養基)和加藥組，細胞以2×103個/孔在96孔板中培養24 h后加藥，分別將各組凍干粉溶于MEM培養基中，設置不同濃度，細胞加藥后24 h(48 h)后，分別加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，檢測570 nm波長處吸光值。

1.2.3 MTT法檢測脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

將實驗設置為陰性對照組(含1/1 000 DMSO的MEM培養基)和加藥組(脂溶性產物溶于DMSO，以1/1 000比例加入MEM培養基)，細胞以2×103個/孔在96孔板中培養24 h后加藥，分別將不同量的脂溶性產物DMSO 溶解液溶于MEM培養基中對應不同加藥濃度，細胞加藥后24 h(48 h)后，分別加入MTT再孵育4 h后加入DMSO，檢測570 nm波長處吸光值OD570。

1.3 統計學分析

2 結果與討論

2.1 土鱉蟲不同提取方式產物得率

考察土鱉蟲不同提取條件下所得產物的得率(產物得率=產物質量/生藥總質量×100%)，結果見表1。由表1可知，水溶性成分產物得率明顯高于脂溶性成分產物得率。土鱉蟲不同溫度水提物的得率并不隨著溫度的升高而升高，其中在50 ℃條件下提取的水提物得率最高為11.40%，土鱉蟲不同溫度的二次水提物與不同時間的二次水提物得率相差不大。

表1 土鱉蟲不同提取方式產物得率Table 1 Product yield of different extraction methods of

2.2 土鱉蟲水提物和脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

圖1為土鱉蟲水提物和脂溶性成分對成骨細胞增殖活性的影響。由圖1可知：土鱉蟲的25 ℃水提物在加藥24和48 h后，各濃度均對成骨細胞有促增殖的作用，且具有時間濃度依賴性關系；在生藥量為2 mg/mL加藥后48 h時，促增殖率達到最大值為39.8%(P<0.001);土鱉蟲的石油醚提取物在加藥后24和48 h，各濃度對成骨細胞生長均有抑制作用，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；土鱉蟲乙酸乙酯提取物在加藥后24和48 h，各濃度均對成骨細胞生長有抑制作用，生藥量為0.1 mg/mL時加藥后48 h，抑制率達到最大值為22.19%(P<0.001)。

與陰性對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001圖1 土鱉蟲的水提物和脂溶性成分對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of water-soluble components and fat-soluble components of E.sinensis on theproliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.3 土鱉蟲不同溫度水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

土鱉蟲在不同溫度條件下提取的水提物作用于MC3T3-E1成骨細胞產生不同的藥效，結果見圖2。由圖2可知：25 ℃水提物在加藥后24 h，不同給藥量對成骨細胞均有促增殖效果；50和90 ℃水提物對成骨細胞生長的影響與陰性對照相比均無顯著性差異。這可能是樣品提取過程用時較長，50和90 ℃的水提物在提取過程中長時間受熱，有效成分失活。

圖2 土鱉蟲不同溫度水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響Fig.2 Effects of water extracts of different temperature ofE.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.4 土鱉蟲不同溫度二次水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

為了進一步研究土鱉蟲中促成骨細胞增殖的有效成分的最大耐熱溫度，繼續用未凍干的25 ℃水提物在不同溫度條件下再次水浴4 h，結果見圖3。

由圖3可知：土鱉蟲的25、37和50 ℃二次水提物在生藥量為0.5～2.0 mg/mL時,加藥后24 h對成骨細胞有促進增殖的作用，與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05)；75 ℃二次水提物對成骨細胞的生長有抑制作用，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；100 ℃二次水提物在生藥量為0.5～2.0 mg/mL時對成骨細胞生長有抑制作用，與陰性對照組相比有統計學差異(P<0.05)。因此，有效成分在50 ℃條件下對成骨細胞生長依然有促增殖的作用，但在75及100 ℃高溫處理后，對成骨細胞生長不僅沒有促增殖的作用，反而對成骨細胞生長有顯著的抑制作用，因此推測土鱉蟲有效成分最大耐熱溫度為50 ℃。

圖3 土鱉蟲不同溫度二次水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響Fig.3 Effect of secondary water extracts of different temperature of E.sinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.5 土鱉蟲不同時間二次水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響

為了繼續探究土鱉蟲中促成骨細胞增殖的有效成分的最大耐熱時間，選取50 ℃為最大耐熱溫度，在其保溫4 h基礎上繼續延長加熱時間，結果見圖4。由圖4可知:土鱉蟲在4、6和8 h時的二次水提物在生藥量為1～2 mg/mL時，對成骨細胞生長有促增殖的作用(P<0.05)；10 h時的二次水提物在生藥量為1.5～2 mg/mL時對成骨細胞生長有促增殖的作用，與陰性對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)；12 h時的二次水提物在生藥量為0.01～1.5 mg/mL時對成骨細胞生長有抑制作用，與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。因此，加熱時間延長到10 h時，部分濃度對成骨細胞生長依然有促增殖作用，但加熱時間延長到12 h后，促增殖活性消失，推測50 ℃時土鱉蟲有效成分最長耐熱時間為10 h。

圖4 土鱉蟲不同時間二次水提物對MC3T3-E1成骨細胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of secondary water extracts of different time of Eupolyphagasinensis on proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts

2.6 討論

土鱉蟲是一類含有氨基酸、蛋白質、脂肪酸、生物堿及微量元素等多種生物活性成分的傳統中藥材，具有抗腫瘤、抗凝血、促進骨折愈合及調節血脂等十分廣泛的藥理作用[8-9]。相對于土鱉蟲廣泛的藥理作用而言，其有效活性成分的研究才剛剛起步，初步研究認為土鱉蟲的脂溶性成分中脂肪酸與抑制腫瘤生長有關[10-11]，水溶性成分中核苷類化合物有鎮靜作用[12]，總生物堿有擴張血管作用[13-15]，純化得到的蛋白單體有纖溶活性[16-17]和抗腫瘤活性[18-19]。

在土鱉蟲促進骨折愈合的研究中，未明確活性成分，目前多以土鱉蟲粗提物進行藥理活性研究。羅佩強[20]研究發現土鱉蟲粉飼喂骨折家兔，可促進家兔血管形成，增加成骨細胞數量和活性，加速鈣鹽沉積。張立國等[21]研究證實，地鱉蟲50%水提物可修復骨細胞活性，增加成骨細胞的數量，加速鈣鹽沉積，從而加速骨折愈合。用土鱉蟲灌胃雄性SD大鼠，制備的含藥血清可促進成骨細胞相關基因cbfa1的表達[22]，從而加速骨折愈合。本課題組前期利用土鱉蟲50%醇提物作用于MC3T3-E1成骨細胞，對成骨細胞有促進作用[23]，并且此活性與本實驗室利用動物模型進行的體內實驗研究結果的相關性較好。因此，使用MC3T3-E1成骨細胞作為土鱉蟲不同提取成分促增殖的活性評價指標，比較土鱉蟲中水溶性成分與脂溶性成分對成骨細胞增殖的作用效果。

3 結論

土鱉蟲作為傳統中藥，制備時不僅要以得率為參考指標，更要考慮總藥效。本研究通過不同方法提取有效成分，利用MTT法比較了各組成分的生物活性。結果顯示，土鱉蟲中水溶性成分具有促MC3T3-E1成骨細胞增殖作用，脂溶性成分無此作用。土鱉蟲25 ℃水提物中有效成分最大耐熱溫度和最長耐熱時間分別為50 ℃、10 h。土鱉蟲水溶性成分中促成骨細胞增殖的具體有效成分仍待深入探討。