不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落功能多樣性分析

陳嘉慧，錢 葉，侯怡鈴，張 萌，丁 祥

(1. 西華師范大學 生命科學學院 西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2. 西華師范大學 環境科學與工程學院，四川 南充 637009)

銀杏(GinkgobilobaL.)屬于世界上最為古老珍貴的孑遺植物，因此它享有植物界“活化石”的美稱。作為世界四大園林植物之一的銀杏是集觀賞、生態、營養和醫藥等功能于一體的天然綠色資源，因此極具研究和保護價值[1-2]。

種類數量繁多的土壤微生物在維持其生態系統穩定性、促進土壤生態系統物質循環和能量流動等方面均發揮著極其重要的作用[3]。大量研究分析發現，土壤微生物活性和群落結構功能多樣性會受到多因素作用，如，植物根系分泌物等能推動其根系土壤微生物的生長發展[4]。劉子雄等[5]研究發現，植物對其根系土壤微生物的種類數量和生態分布等方面極為重要，為土壤提供營養成分和有機物質等[6]。Waid等[7]研究發現，植物能促進根系土壤微生物多樣性發展，使其協同進化。張安才等[8]研究發現，銀杏樹表現出明顯的根際效應，銀杏樹通過為根系土壤微生物提供營養物質來影響其數量、種類和活性等；同時，根系土壤微生物的代謝也會影響根營養的吸收和銀杏樹的生長。

近十多年來，土壤微生物群落功能多樣性研究發展迅速，趨于成熟，多種研究方法技術被廣泛應用，如：高通量測序技術、Biolog微平板技術、聚合酶鏈式反應 變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)、磷脂脂肪酸技術(PLFA)，特別是Biolog-生態板(ECO)技術操作簡單快速、數據量豐富，具有直觀迅速展現微生物代謝功能多樣性特征[9]等優點，因此被廣泛應用。

運用Biolog-ECO技術深入分析幼年期、掛果期和盛果期3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物代謝功能多樣性，旨在揭示不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落功能多樣性特征，為進一步研究銀杏樹與根系土壤微生物的相互作用機制和土壤微生物群落多樣性提供一定的科學依據，為進一步保護利用銀杏資源和土壤微生物資源提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 研究地區概況

本研究實驗地位于四川省南充市高坪區東觀鎮(N30°46.733′，E106°16.451′)，亞熱帶濕潤季風氣候，處于四川盆地中部、嘉陵江中游東岸，屬于低山丘陵。年均降水量1 007 mm，年均氣溫17.6 ℃，日照率為27%～35%，年平均日照時數為1 200～1 500 h 。

1.2 樣地設計及樣品采集

實驗樣品采集于2017年4月，通過等距取樣法選取同一銀杏林的10年以下(幼年期)、20年(掛果期)和40年以上(盛果期)這3個年齡段的銀杏樹各3棵，在距樹干底部20 cm處采集表層土壤，去除土樣里的植物根系和礫石等雜質后均勻混合。根據銀杏樹年齡階段的不同，分別將銀杏樹幼年期、掛果期、盛果期的土壤樣品標記為A11、B11、C11，無菌封裝后低溫保存，便于后續的實驗順利進行。

1.3 儀器與設備

1510-04570型酶標儀、MAXQ4000型恒溫搖床，賽默飛世爾科技有限公司；DPX-9272B-1型電熱恒溫培養箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.4 方法

通過采用Biolog-ECO技術，研究分析幼年期、掛果期、盛果期3個年齡段的銀杏樹根系土壤微生物多樣性。首先取99 mL滅菌蒸餾水和1 g樣品到250 mL錐形瓶中，25 ℃、250 r/min恒溫振蕩20 min后，4 ℃靜置30 min，再取上清液150 μL接種到ECO板中25 ℃恒溫培養10 d，每隔24 h檢測其在590和750 nm波長下的OD590和OD750。

1.5 數據處理

將測定的OD590減去OD750，所得數據以用于后續的計算分析[9]。通過Origin 2017對各項數據作柱狀圖；通過SPSS 22.0對測定的原始數據進行相應的方差分析(ANOVA)和主成分分析(PCA)。

2 結果與討論

2.1 銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝能力分析

在Biolog-ECO板中，31種碳源是土壤微生物的唯一能量來源，平均顏色變化率(AWCD)與碳源利用能力呈正相關關系[10]。圖1為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落AWCD時間變化曲線。由圖1可知：培養初期0～24 h時，AWCD值均較低，接近于0，說明不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物都幾乎沒有利用碳源，群落代謝能力低；在24 h后，AWCD值的增速加快，由此說明土壤微生物逐漸大量利用碳源，繁殖速率加快，群落代謝能力增加，特別是培養時間為24～144 h時，AWCD值增速最大；在144～240 h時，AWCD值增速逐漸放緩；在240 h 時，AWCD值達到最大，即幼年期(1.4)>盛果期(1.08)>掛果期(0.9)，說明由于競爭、單一碳源限制等因素，微生物數量的增長率逐漸下降，碳源的利用率達到最大值。隨著培養時間的增加，不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物AWCD值呈現幼年期>盛果期>掛果期的“S”形上升變化趨勢，即不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性和代謝能力呈現幼年期>盛果期>掛果期的“S”形上升變化趨勢，說明土壤微生物在Biolog-ECO板內適應良好。

圖1 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落AWCD時間變化曲線Fig.1 AWCD time curves of the soil microbialcommunity of ginkgo root in different ages

對不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝能力方差分析，結果見表1。由表1可知，在48 h時，幼年期、掛果期、盛果期的銀杏樹根系土壤微生物的碳源代謝能力差異不顯著(P<0.05)；培養時間為0 h和72～120 h時，其碳源代謝能力差異顯著(P<0.05)，培養時間為24 h和144～240 h時，差異極顯著(P<0.01)。由此說明，銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝能力呈現幼年期>盛果期>掛果期的趨勢，且差異極為顯著。

表1 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝能力方差分析Table 1 Variance analysis for soil microbial community of ginkgo root at different ages

2.2 銀杏樹根系土壤微生物群落對6大類碳源利用率分析

圖2為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物對6大類碳源的利用情況。由圖2可知：隨著培養時間的增長，Biolog-ECO板中的6大類碳源平均顏色變化率(AWCD)從較低到迅速升高，最后增速放緩趨近于0；3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物對碳水化合物類和醇類有機碳源的利用程度較低，對氨基酸類、酯類、胺類和酸類碳源的利用程度較高，說明氨基酸類、酯類、胺類和酸類是其主要的碳源利用類型。李驍等[11]研究發現，在植物生長過程中，其根系會釋放大量的氨基酸等有機物，因此推測銀杏樹生長過程中，其根系分泌釋放的氨基酸類、酯類、胺類和酸類碳源較多，碳水化合物類和醇類碳源較少[12]。雖然3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物對6大類碳源利用程度存在一定的差異，但總體來說，銀杏樹根系土壤微生物的碳源利用程度呈現幼年期>盛果期>掛果期的趨勢，說明由于銀杏樹年齡段的不同，其根系土壤微環境會影響微生物對碳源的利用[13-14]。

圖2 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物對6大類碳源的利用情況Fig.2 Utilization of 6 kinds of carbon sources in the root soil microorganism of ginkgo tree at different ages

2.3 銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝特征主成分分析

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物在培養96 h(對數期)時，將測得的利用31種碳源的光密度值(OD值)原始數據進行數據處理和主成分分析(PCA)[15-16]，如表2所示。由表2可知，特征值大于1的主成分有7個，其累計貢獻率分別為41.576%、15.709%、12.047%、9.789%、9.635%、5.409%和3.475%，提取貢獻率最高的2個主成分，其總貢獻率達到57.285%，其中第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)分別可解釋變量方差的41.576%、15.709%，其余6個主成分貢獻率較低，故不予考慮。因此根據變異的主要來源PC1和PC2來構建二維坐標，能直接體現微生物群落代謝特征[17]。

表2 方差分解主成分提取分析Table 2 Analysis of total variance explained

對3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝碳源特性進行PCA分析，結果如圖 3 所示。由圖3可知：PC1能解釋41.576%變異的原因，因此其相關性關鍵體現于PC1軸，幼年期主要聚集在PC1正端、PC2負端；掛果期主要聚集在PC1負端、PC2正端；盛果期主要聚集在PC1負端、PC2正端。說明PC1能區分幼年期、盛果期和掛果期，并呈現一定的相關性，因此銀杏樹根系土壤微生物群落代謝特征主要與樹齡相關[18]，且呈現一定的正相關；PC2主要體現了銀杏樹個體之間的差異。土壤微生物群落明顯分為2簇，掛果期和盛果期聚為1簇，幼年期為1簇，表明掛果期和盛果期的銀杏樹根系土壤微生物對31種碳源的利用比較相似。

圖3 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝主成分分析Fig.3 Principal component analysis for carbon utilization of soil microbial communitiesof ginkgo root at different ages

2.4 銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數分析

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物在培養時間為96 h時，測量計算分析得到的Shannon-Weaver指數(H)、豐富度指數(S)、均勻度指數(E)和McIntosh指數(U)能體現3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落的碳源代謝種類多樣性特征[19]。表3為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數。由表3可知：就H而言，呈現掛果期(3.325)>幼年期(3.320)>盛果期(3.289)，并差異極為顯著(P>0.01)，表明掛果期銀杏樹根系土壤微生物群落種類多而平均，且不同年齡段的銀杏樹根系環境微生物多樣性豐富程度差異極為顯著；就S而言，幼年期(29.667)>掛果期(28.333)>盛果期(27.333)，并且沒有顯著差異，說明微生物選擇性利用碳源種類數目并沒有顯著差異，幼年期的利用碳源數目最多；就E而言，盛果期(0.995)>掛果期(0.994)>幼年期(0.980)，并且沒有顯著差異，因此盛果期銀杏樹根系土壤微生物群落數目分配的均勻程度及碳源利用種類最高；就U而言，呈現幼年期(5.815)>盛果期(4.306)>掛果期(3.901)和極顯著差異(P> 0.01)，說明微生物群落均勻程度差異極為顯著，且土壤微生物種類和碳源利用程度呈現幼年期>盛果期>掛果期的趨勢。由此可見，銀杏根系土壤微生物群落功能多樣性、均勻程度及代謝活性等在一定程度上受銀杏樹年齡的影響，并主要體現在碳源的利用上[20]。

表3 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數Table 3 The soil microbial community diversity indices of ginkgo root at different ages

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性存在顯著差異，可能的原因有：

1)銀杏樹根系土壤微生物種類數量等會受到其根系分泌物不同程度影響。隨著樹齡的增加，根系分泌速率呈現高—低—高的趨勢[21]，其根系土壤微環境會影響微生物的種類數目和對碳源的利用情況，調節土壤微生物的生長代謝[5]。

2) 在Biolog-ECO板的96個微孔中，31種碳源無法完全呈現銀杏樹根系土壤微生物的自然環境條件，無法完整反映土壤微生物群落代謝功能多樣性[22]。

3 結論

運用Biolog-ECO技術分析3個年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝功能多樣性特征規律，得到了一些初步的結果，但是關于銀杏樹根系對土壤微生物的作用機制還有待研究。因此，今后將會進一步利用高通量測序技術和PCR-DGGE技術，圍繞銀杏樹根系土壤微生物群落組成、結構和功能等方面逐步展開研究，以期更為全面深入闡釋3個年齡段銀杏樹對其根系土壤微生物群落功能結構組成的作用。