離子色譜法測(cè)定靈芝超聲水提取物中4種代表有機(jī)酸的含量

華 豐

(常州市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，江蘇 常州 213004)

靈芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.是擔(dān)子菌綱，多孔菌科靈芝屬真菌,為藥食兩用真菌，在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史[1]。靈芝一直被視為可以滋補(bǔ)強(qiáng)身、扶正固本、延年益壽的珍品,是我國(guó)中藥及傳統(tǒng)食療寶庫(kù)中的瑰寶，其中分布最廣、藥用價(jià)值最高的品種為赤芝和紫芝[2-3]。現(xiàn)代研究表明:靈芝化學(xué)成分復(fù)雜，其中已發(fā)現(xiàn)的生物活性成分有將近200種，可分為多糖類、三萜類、生物堿類、甾醇類、氨基酸蛋白質(zhì)類、核苷類、呋喃類、油脂類、有機(jī)鍺和礦質(zhì)元素等10大類，但目前的研究重心主要集中在對(duì)其多糖類成分的分析上[4-5]。已有藥理研究表明:靈芝多糖能抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫[6-8]，可促進(jìn)葡萄糖在外周組織的利用，具有刺激胰島素分泌、降血糖血脂[9]、保肝、消炎[10]等方面的生物學(xué)活性。據(jù)報(bào)道，靈芝中的有機(jī)酸類成分主要分布在靈芝孢子油中，且為揮發(fā)性的不飽和脂肪酸，而在靈芝水提物中，除了多糖外，還發(fā)現(xiàn)含有少量的有機(jī)酸類成分[11]。隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和藥理學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始重視中藥中的有機(jī)酸類成分。常用的有機(jī)酸含量測(cè)定方法有氣相色譜法[12]、高效液相色譜法[13]、離子色譜法[14]和毛細(xì)管電泳法[15]等。

目前國(guó)內(nèi)外大多利用高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)有機(jī)酸，而氣相色譜法通常用來(lái)測(cè)定具有揮發(fā)性的不飽和脂肪酸，與其他幾種方法相比，近年發(fā)展起來(lái)的離子色譜法操作更為簡(jiǎn)便，樣品前處理簡(jiǎn)單，尤其適合極性大的親水性有機(jī)酸類成分，對(duì)強(qiáng)親水性和強(qiáng)揮發(fā)性的物質(zhì)不會(huì)造成損失，受無(wú)機(jī)陰離子的干擾小，對(duì)有機(jī)酸的分析具有良好專屬性且檢測(cè)限低[16]。目前，靈芝中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為多糖類和三萜類，對(duì)其中有機(jī)酸類成分的藥理活性尚未見(jiàn)報(bào)道，不管從活性成分還是雜質(zhì)方面進(jìn)行研究，建立一種快速、高效的含量測(cè)定方法都是很有必要的。為進(jìn)一步闡明靈芝水提物中的物質(zhì)基礎(chǔ)組成，為其安全性、有效性和質(zhì)量可控性提供參考，筆者探索離子色譜法對(duì)其4種代表有機(jī)酸含量的測(cè)定方法，以期為相關(guān)中藥資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

850型離子色譜儀-電導(dǎo)檢測(cè)器，瑞士萬(wàn)通公司；Quintix 224-1CN0電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；所有實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率為18.2 MΩ的超純水。

草酸(批號(hào)：01097-201101，純度>99%)，DL-酒石酸(批號(hào)：190072-201501，純度>98%)，DL-蘋(píng)果酸(批號(hào)：190013-201001，純度>98%)，對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙醇酸(批號(hào)：P1059879，純度>99%)購(gòu)自上海市阿達(dá)瑪斯公司，其他試劑均為分析純。

1.2 藥材

靈芝子實(shí)體(3批批號(hào)分別為：170808、170812和170818)，購(gòu)自浙江龍泉市科達(dá)農(nóng)副產(chǎn)品有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Transgenomic ICSep Ion 300陰離子交換柱(4.6 mm×250 mm)；電導(dǎo)檢測(cè)器條件為電池常數(shù)15.0/cm，恒溫器溫度40 ℃，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為8 mmol/L H2SO4溶液等度洗脫，流速0.5 mL/min，抑制系統(tǒng)為100 mmol/L LiCl溶液，進(jìn)樣量20 μL。

1.4 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸的對(duì)照品適量，分別加水溶解制成1 mL含1.0 mg對(duì)照品的貯備液。分別精密吸取各貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。

1.5 供試品溶液的制備

將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)6號(hào)篩(150 μm±6.6 μm)。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末，加入超純水30 mL，超聲(功率400 W，頻率40 kHz)提取30 min。精密移取1.0 mL至20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)On Guard RP柱和0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

在1.3項(xiàng)中的色譜條件下，草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸4種有機(jī)酸分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以5種有機(jī)酸計(jì)，均不低于4 000(圖1)。由圖1可知，該色譜系統(tǒng)適用性良好，可以用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定靈芝提取物中的有機(jī)酸含量。

TransgenomicICSep Ion 300陰離子交換柱是專門(mén)針對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行分離的色譜柱，柱效高，出峰時(shí)間短。使用淋洗液自動(dòng)發(fā)生系統(tǒng)等度洗脫，淋洗液為8 mmol/L H2SO4溶液，同時(shí)使用100 mmol/L LiCl作為抑制系統(tǒng)，儀器運(yùn)行基線平穩(wěn)，分析重現(xiàn)性好。

1為草酸，2為DL-酒石酸，3為DL-蘋(píng)果酸，4為乙醇酸；對(duì)照品質(zhì)量濃度均為20 μg/mL圖1 對(duì)照品溶液(a)、供試品溶液(b)的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of reference solution (a)and test solution (b)

2.2 線性關(guān)系的考察結(jié)果

精密移取1.4項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(μg/mL) 為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：4種有機(jī)酸成分回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在1～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 The test results of linear relationship

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

分別移取1.4項(xiàng)中方法配制所得的混合對(duì)照品溶液0.5,2.5和 5 mL至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為5、25和 50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算得草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 The test results of precision tests(n=6)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

取同一批樣品(批號(hào)：170808)6份，按1.5項(xiàng)中方法制備供試品溶液，依上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果樣品中，草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸的平均含量(n=6) 分別為0.12%、0.31%、0.76%和1.51%；RSD分別為1.26%、1.44%、0.77%和0.94%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取2.4項(xiàng)中制備的同一份供試品溶液，于制備后0、2、4、6、8、12和24 h 進(jìn)樣測(cè)定(n=3)，分別計(jì)算供試品溶液中4種有機(jī)酸在24 h內(nèi)峰面積的精密度以及與0 h比較的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 The test results of stability tests (n=3)

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

稱取已知含量的靈芝子實(shí)體樣品(批號(hào)：170808)0.5 g，共6份，分別精密加入相當(dāng)于草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸0.5、1.5、4.0和7.5 mg的混合對(duì)照品溶液1 mL，分別按1.5項(xiàng)中供試品溶液制備方法處理，分別進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算草酸、DL-酒石酸、DL-蘋(píng)果酸和乙醇酸的回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，回收率在98.2%～100.4%，RSD均小于2%。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of sample addition recovery(n=6)

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

取3批赤芝子實(shí)體樣品，按1.5項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，3批赤芝子實(shí)體水提物中的有機(jī)酸含量基本一致。

表5 3批靈芝提取物中4種有機(jī)酸含量的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 5 Results of determination of 4 organic acids in 3 batches ganoderma extract (n=3)

因靈芝所含化學(xué)成分復(fù)雜，主要有靈芝多糖、三萜類、氨基酸、核苷類、生物堿和甾醇等，在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者還考察了HPLC法，但由于所含成分較多，有機(jī)酸成分與其他成分不能得到有效分離，而離子色譜法經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的樣品前處理，就能達(dá)到良好的分離效果，故最終選擇離子色譜法對(duì)靈芝提取物中的有機(jī)酸進(jìn)行含量測(cè)定。同時(shí)，為盡量避免這些化學(xué)成分的干擾，影響離子色譜分離效果，樣品必須經(jīng)過(guò)一定的前處理。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)On Guard RP 前處理柱可有效去除樣品中的大多數(shù)雜質(zhì)的干擾。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究所建立的離子色譜方法具有分離效果好、穩(wěn)定性佳、含量測(cè)定準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可為靈芝及其他中藥品種中小分子有機(jī)酸的測(cè)定提供參考，也為闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥資源的深入開(kāi)發(fā)提供一種快速、高效的方法學(xué)借鑒。