維生素K2(MK-7)生產菌株納豆芽孢桿菌的誘變選育及其工藝優化

徐 行，劉 珍，李 會，張曉梅，史勁松，陳杰鵬，段麗麗，許正宏

(1. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2. 廣東雙駿生物科技有限公司，廣東 汕頭 515071；3. 江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

維生素K2(menaquinone，MK)是一系列具有葉綠醌活性的脂溶性維生素，為甲萘醌系列化合物，具有4～13個重復的異戊二烯單元，分別由MK-4至MK-13表示， MK-7為天然維生素K2，其生物活性最為顯著[1]。MK-7可以有效降低骨折以及一些心血管疾病的風險[2]。此外，MK-7在臨床上還被廣泛應用于抗凝血、抗肝癌、利尿及強化肝臟解毒等[3]，是人體中無法缺少的維生素之一。目前，合成維生素K2(MK-7)的方法包括化學法和生物法。其中，化學合成維生素K2(MK-7)類化合物的工藝較多，但存在多種限制因素：如缺乏前體物質；反應過程會產生較多副產物同時產生異構體，從而導致產率低，并伴隨環境污染的問題；另外，化學法反應生成的維生素K2(MK-7)活性都較低，因其側鏈的異戊二烯結構多為順式結構。而獲取活性較高的維生素K2(MK-7)主要由生物發酵法制得，且為全反式天然維生素K2。因此，能夠獲得活性較高的維生素K2的微生物發酵法日益受到重視。

近年來，已報道的生物法生產維生素K2(MK-7)的微生物有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢菌(B.amyloliquefaciens)[4]和乳酸菌[5]等，而目前工業化理想的 MK-7 生產菌株是納豆芽孢桿菌(B.subtilisnatto)[6]。但利用微生物發酵生產維生素K2(MK-7)的研究仍存在發酵濃度低、發酵周期較長等問題。因此，要切實提高MK-7的生物合成濃度，獲得性能優越的菌株極為重要。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術能夠產生具有高活性離子濃度的等離子體射流，并作用于微生物體誘發突變。ARTP具有安全無污染、活性離子濃度高、快速方便且操作可控性強等優點[7]，如:王詩卉等[8]利用ARTP技術對解淀粉芽孢桿菌進行ARTP誘變，獲得高效生產3-羥基丁酮的菌株；李光等[9]也通過ARTP對枯草芽孢桿菌的誘變獲得表面活性素(surfactin)高產菌株。而目前尚未有文獻報道利用ARTP技術對納豆芽孢桿菌進行誘變選育從而獲得高產維生素K2(MK-7)的菌株。

筆者所在實驗室前期篩選獲得了一株產MK-7的納豆芽孢桿菌ND-1，但其產量較低，僅為20.76 mg/L。因此，本文中，筆者為了獲得高產維生素K2(MK-7)且傳代穩定的生產菌株，以納豆芽孢桿菌ND-1為出發菌株，采用ARTP誘變技術進行菌株誘變，并對培養基組分及培養條件進行優化，以期為后續菌株的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1，由本實驗室篩選保藏。

種子培養基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨40、NaCl 5、牛肉膏5、酵母膏5。

發酵培養基(g/L)：甘油50、大豆蛋白胨189、酵母粉50、K2HPO40.06。

以上培養基都調pH至7.0～7.2[10]后滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的ARTP誘變及誘變時間選擇

挑取B.nattoND-1單菌落接種至種子培養基中培養至對數生長期，取0.01 mL 菌液均勻地涂在金屬載片上，放入ARTP誘變系統操作室里，在功率100 W、通氣量為10 L/min條件下[11]分別誘變10、20、30、40和50 s。誘變結束后，用鑷子把金屬載片移至裝有1 mL培養基的EP管里培養3～4 h，培養結束后分別稀釋涂布并計數，計算誘變致死率，確定最佳誘變時間。在最佳誘變處理時間下，對納豆芽孢桿菌進行ARTP誘變操作。

1.2.2 1-羥基-2-萘甲酸(HNA)最適篩選濃度的確定及初篩

初篩采取平板篩選法。HNA是MK-7合成過程中萘醌骨架1，4-二羥基-2-萘甲酸(DNHA)的結構類似物[12]，因此可以采用抗結構類似物平板法進行菌株篩選。將誘變后的菌液進行稀釋涂布得到各突變菌落，選取100個突變菌株在種子培養基中進行培養后，分別在含梯度質量濃度(50、60、70、80和90 mg/L)HNA的平板上點涂，根據在各濃度HNA平板上存活的菌株數量計算其篩選效率，從而選擇最適的HNA篩選濃度。

將誘變后菌液稀釋涂布在含最適HNA濃度的平板上，培養得到數個單菌落，擴大培養并保存備用，進一步通過發酵驗證進行復篩。

1.2.3 誘變菌株的復篩

將初步篩選后得到的菌株接至種子培養基中，37 ℃、220 r/min培養12 h后，按1.0%的體積比接入發酵培養基，37 ℃條件下靜置培養5 d后測定MK-7濃度，每個菌株做3個重復，篩選優勢突變株并保存菌株，進行發酵實驗，評價突變株的遺傳穩定性。

1.2.4 搖瓶發酵初始條件

將誘變選育得到的菌株接種至種子培養基中，37 ℃、220 r/min培養12 h后得種子液，按體積比為1.0%的接種量接入裝有30 mL發酵培養基的250 mL三角燒瓶中，在37 ℃條件下靜置培養5 d后得發酵液。

1.2.5 產物提取

配制萃取液——異丙醇-正己烷溶液(體積比1∶ 2)[13]，準確量取1 mL待測發酵液，用等體積的萃取劑萃取，劇烈振蕩2 min后8 000 r/min離心1 min，取上層有機相，重復同樣步驟萃取3次，離心取上清液。3次萃取上清液合并。得發酵液提取物數毫升置于2 mL離心管中，靜置風干待用。

1.2.6 分析方法

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測產物，用色譜純甲醇復溶上述產物后，用0.22 μm的有機膜過濾除雜。色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇，柱溫為40 ℃，檢測波長為270 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL[14]。

1.2.7 正交試驗設計優化培養基組分

根據初始培養基設計四因素三水平正交試驗，按照試驗設計分別配制發酵培養基。以1.0%的接種量將種子液轉接到發酵培養液中，37 ℃靜置培養5 d。采用統計學方法分析實驗結果，確定最優培養基配方。

1.2.8 發酵條件優化實驗

以初始發酵條件為基礎，采用優化后發酵培養基，采用單因素優化方法，分別測定不同接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)、發酵溫度(32、36、40、44和48 ℃)和搖床轉速(0、20、40、60、80和100 r/min)對發酵生產維生素K2(MK-7)的影響。優化時，每一因素的優化均在前一因素優化的基礎上進行，且其他條件不變。

2 結果與討論

2.1 高產維生素K2(MK-7)的納豆芽孢桿菌的ARTP誘變

2.1.1 ARTP誘變的致死率

將納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1經不同時間的ARTP誘變后進行再培養并計算其致死率，結果如圖1所示。由圖1可知，菌體致死率隨ARTP誘變時間的增加不斷提高。當照射時間為40 s時，菌體致死率已達到98.0%左右，但當誘變時間為50 s時，菌體幾乎全部致死存活。參照文獻[15]報道等離子誘變在致死率高于95%時易發生正向突變的結果，故選擇40 s為最佳誘變時長。

圖1 不同誘變時間條件下菌體的致死率Fig.1 Lethality of the cells in different mutagenic time

2.1.2 誘變菌株的篩選

由于HNA為MK-7合成過程中萘醌骨架1，4-二羥基-2-萘甲酸(DNHA)的結構類似物，因此可以采用抗結構類似物平板法進行菌株篩選。設置HNA濃度梯度進行篩選，得不同濃度HNA條件下對菌株的篩選效率，結果見表1。由表1可知：當HNA用量為50～80 mg/L時，篩選效率低；當HNA用量達到90 mg/L時，對菌落的生長產生了較高壓力，篩選效率達到95%以上。因此，選用90 mg/L為HNA篩選質量濃度。將經誘變后的菌液稀釋后涂布在含90 mg/L濃度的HNA平板上，最終得到32株經過高濃度HNA抗性平板篩選的突變菌株。

表1 不同濃度HNA條件下的菌株篩選率Table 1 Screening efficiency under different HNA dosage

將經過高濃度HNA抗性篩選后得到的32株菌株進行擴大培養，并經過搖瓶靜置發酵后檢測MK-7的產量，結果見圖2。由圖2可知，經過ARTP誘變后的突變菌株ND-1-A27，該突變菌株發酵產MK-7可達到(48.05±3.81) mg/L，比原始菌株ND-1產MK-7能力提高了約60%。

注：無轉化能力的誘變菌株編號未顯示圖2 誘變菌株產MK-7能力Fig.2 MK-7 yield of mutagenized strain

2.1.3 突變菌株的傳代穩定性

將突變株ND-1-A27進行傳代培養，以考察其遺傳穩定性，結果見圖3。由圖3可知，經過連續5代的培養，MK-7的產量為45.16～48.95 mg/L，表明該突變株ND-1-A27的遺傳穩定性好，可以作為優勢菌株進行后續的研究。

圖3 突變菌株ND-1-A27的遺傳穩定性Fig.3 Genetic stability of mutant strain ND-1-A27

2.2 突變菌株的發酵工藝優化

2.2.1 培養基組分的優化

培養基的組分，尤其是碳氮源對微生物的生長和產物生成具有重要的影響。本實驗在前期實驗基礎上對培養基組分中碳氮源設計四因素三水平正交試驗，以MK-7濃度為指標，選用L9(33)正交表進行培養基的進一步優化，并進行極差分析，正交試驗設計及結果見表2，正交試驗的極差分析結果見表3。

由表3可知，甘油濃度對轉化產物的形成影響最為顯著，然后依次是大豆蛋白胨、K2HPO4、酵母粉。正交試驗得到的理論最適培養基中碳氮源組合為A3B2C1D2，即甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L，在此條件下MK-7產量最高。本研究對以上理論最適培養基組分進行了實驗驗證，實驗重復3次，結果表明，在該最適條件下，MK-7的平均產量為(52.21±1.57) mg/L,從而證明該實驗結果可信。

表3 正交試驗的極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiments

2.2.2 發酵條件的優化

在以上最適培養基的基礎上，對初始培養條件進行進一步優化。因為影響維生素K2(MK-7)的培養條件包括接種量、發酵溫度及培養方式等，因此在搖瓶中分別對其優化，結果如圖4～6所示。

圖4 接種量對MK-7濃度的影響Fig.4 Effects of inoculum on MK-7 yield

由圖4可知：當接種量小于2%時，MK-7產量較低；當接種量為2%時，MK-7產量達到最高；當接種量高于2%時，MK-7產量隨接種量的增加而逐漸下降。這表明突變菌株ND-1-A27的最適接種量為2%。

在最適接種量為2%的基礎上對發酵溫度進行優化，結果如圖5所示。由圖5可知：當發酵溫度低于40 ℃時，MK-7產量隨著溫度的升高而增加；當發酵溫度為40 ℃時，突變菌株MK-7產量最高；發酵溫度高于40 ℃后，MK-7產量隨溫度的增加而逐漸下降，表明突變菌株ND-1-A27最適發酵培養溫度為40 ℃。

圖5 發酵溫度對MK-7濃度的影響Fig.5 Effects of temperature on MK-7 yield

在上述接種量及溫度優化的基礎上考察搖床轉速對MK-7產量的影響，結果見圖6。由圖6可知，當靜置發酵時，MK-7產量最高，達到(53.31±3.17)mg/L。而隨著轉速的增加，MK-7的產量下降。而且發現在發酵結束時靜置培養中芽孢形成率高達93.4%，而轉速提高到100 r/min時芽孢形成率僅為75.7%，由此可見靜態培養更有利于芽孢的形成。而Farrand等[16]研究發現，維生素K2(MK-7)的生產與菌體內芽孢的形成呈正相關，因此，MK-7的生產的最適培養方式為靜置培養。

圖6 搖床轉速對MK-7濃度的影響Fig.6 Effects of shaker speed on MK-7 yield

2.2.3 突變菌株的發酵過程曲線

經過對高產突變菌株的培養基及培養條件優化后，確定了突變株ND-1-A27的最適發酵工藝，即甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L，種子液接種量2%，發酵溫度40 ℃，靜置發酵。將突變株ND-1-A27在上述優化后培養工藝下進行發酵培養6 d，連續取樣，測定菌體干質量以及MK-7的產量變化，得到圖7發酵過程曲線。由圖7可知：在0～3 d時，菌體快速生長，培養基中的碳源甘油被快速利用，且MK-7隨著菌體的生長快速積累；隨著發酵時間的延長，到第4～5天時菌體生長趨于穩定，幾乎不再繼續增長，甘油消耗較慢直至消耗完全，但MK-7仍繼續積累至第5天達到最高值(53.88±2.03)mg/L并保持穩定。

圖7 ND-1-A27發酵過程中MK-7濃度及生物量變化情況Fig.7 MK-7 yield and biomass changes of ND-1-A27 during the fermentation process

3 結論

以實驗室篩選保存的納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1為出發菌株，采用等離子誘變技術(ARTP)對菌株進行誘變選育及發酵工藝優化。考察了不同濃度HNA對突變菌株的篩選效率，確定了含90 mg/L HNA的平板具有較好的篩選效率，達到95%以上。通過含90 mg/L HNA平板對誘變菌株的初步篩選，成功獲得了1株遺傳穩定性良好，且能高效發酵生產MK-7的突變菌株ND-1-A27，其生產MK-7的產量為48.05 mg/L，比原始菌株提高了約60%。接著對突變菌株的發酵培養基進行了正交試驗優化，確定了最優培養基為甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L。此外確定了最佳的接種量為2%，最佳發酵溫度為40 ℃，最適發酵條件為靜置發酵。優化后發酵生產MK-7的產量達到(53.88±2.03) mg/L。

本研究對維生素K2(MK-7)高產菌株的誘變選育具有一定的參考意義，為工業化生產奠定基礎。當前對該菌株產維生素K2(MK-7)的機制研究在進行之中，通過采用代謝工程手段進一步提高菌株ND-1-A27生產維生素K2(MK-7)能力的研究是我們今后工作的方向。后續研究希望通過進一步的菌株改造及放大培養，為MK-7工業化生產，創造更大的價值。