響應面法優化羰基還原酶產生菌Cyberlindnera saturnus發酵培養基

肖美娟，朱治任，劉月旺，王 普

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

甾體化合物是指分子中含有環戊烷多氫菲母核結構的生物活性分子，對人體發揮著重要的生理調節作用，廣泛用于抗炎、免疫、計劃生育及抗癌等領域[1-4]，是僅次于抗生素的第二大類藥物。利用化學全合成法制備甾體藥物，其工藝路線復雜、反應條件較為苛刻、環境污染大。與化學合成法相比，采用微生物轉化法制備甾體藥物中間體工藝路線簡單，生產效率高，具有更高的特異性，符合“綠色化學”理念[5-8]。因此，微生物轉化技術在甾體藥物制備領域備受關注。有關此方面的研究多集中在微生物脫氫[9-10]、微生物羥基化[11-12]等反應，關于微生物催化還原制備甾類藥物中間體的研究很少。

左炔諾孕酮(levonorgestrel)是應用廣泛的避孕藥，在婦科領域占有重要地位[13-14]。目前其制備主要采用化學法。Wong等[15]利用一鍋法合成工藝，以44.6 mmol/L的3-甲氧基-18-甲基雄甾-2,5-10-二烯-17-酮與Me3SiC≡CLi反應1 h后，加入0.05倍量的四丁基氟化銨進行脫甲硅烷基，最終得到40.3 mmol/L左炔諾孕酮，產率為90%。近年來也有研究者利用生物催化還原乙基二酮制備左炔諾孕酮關鍵手性中間體(13R,17S)-乙基仲醇。如Dall′oglio等[16]利用混合床反應體系進行不同酮類底物的還原，以KRED1-Pglu和BmGDH為催化劑，加入3 mmol/L乙基二酮反應6 h后，(13R,17S)-乙基仲醇產率為65%。Contente等[17]以KRED1-Pglu為催化劑合成(13R,17S)-乙基仲醇，加入6.5 mmol/L乙基二酮反應6 h，產率達65%，對映體過量值(e.e.)>98%；為獲得更高的產率，他們還篩選了不同種類酵母菌作為催化劑進行生物還原反應：利用釀酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK113-7D催化時，加入10 mmol/L的乙基二酮底物轉化24 h，產率達95%，e.e.>98%。圖1為生物還原制備左炔諾孕酮關鍵手性中間體的反應過程[17]。

圖1 生物不對稱還原乙基二酮制備(13R,17S)-乙基仲醇[17]Fig.1 Asymmetric reduction of ethyl secondione to (13R,17S)-ethyl secols by microbial cells[17]

筆者所在課題組利用實驗室篩選菌株CyberlindnerasaturnusZJPH1807全細胞催化乙基二酮不對稱還原制備(13R,17S)-乙基仲醇，發現其反應特異性很高，e.e.>99.9%。由于微生物生長和產羰基還原酶能力與發酵培養基的組分密切相關[18-19]，為進一步提高該菌株的轉化能力，本文中，筆者采用單因素試驗和響應面法對菌株C.saturnusZJPH1807生長和產羰基還原酶的最適發酵培養基組成進行優化，以期獲得最佳配比，為進一步應用提供數據。

1 材料與方法

1.1 材料

CyberlindnerasaturnusZJPH1807，筆者所在實驗室保藏菌株。

正己烷、異丙醇(色譜純)，阿拉丁試劑有限公司；其他常規試劑均為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

斜面培養基(g/L)：葡萄糖 15、蛋白胨 7.5、酵母膏 6、(NH4)2SO43、KH2PO41.5、NaCl 0.75、MgSO4·7H2O 0.75、瓊脂粉 20。

種子培養基和初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖 15、蛋白胨 20、酵母膏 10、(NH4)2SO42、KH2PO42、NaCl 1、MgSO4·7H2O 0.5。

以上培養基都調pH至6.5。

1.2 菌體培養方法

斜面培養：在30 ℃條件下培養48～72 h。

種子培養：從斜面培養基上挑取一定量菌體，接入裝有100 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養12 h。

發酵培養：將10%(體積分數)種子液接入裝有發酵培養基的搖瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h。

1.3 單因素優化實驗設計

分別考察發酵培養基中碳源、氮源和無機鹽等主要組分及其加量對菌株C.saturnusZJPH1807生長和產酶的影響。

1.4 響應面優化發酵培養基組成

根據最適碳、氮源和無機鹽的優選結果，選擇葡萄糖、酵母膏、NH4Cl和KH2PO4等主要因素，采用Design-Expert V8.0.6軟件設計四因素三水平Box-Behnken實驗，并進行數據分析[20-21]。

1.5 生物量測定

采用比濁法和細胞干質量法測定。

1.6 羰基還原酶活力測定

稱取1.5 g濕菌體懸浮于10 mL磷酸緩沖液中(0.1 mol/L，pH 6.5)，加入16 mmol/L乙基二酮底物，100 g/L葡萄糖為輔助底物，在30 ℃、200 r/min條件下轉化2 h。反應結束后，轉化液經等體積的乙酸乙酯萃取后用于分析檢測。

采用高效液相色譜(HPLC)法檢測樣品中底物、產物含量，計算得到羰基還原酶活力。色譜柱型號，Lux 5 μm Cellulose-2 (4.6 mm×250 mm，Phenomenex公司)，流動相為正己烷/異丙醇(兩者體積比為85∶ 15)，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm。

羰基還原酶活力定義：在轉化條件下，每分鐘還原乙基二酮生成1 μmol/L的 (13R,17S)-乙基仲醇產物所需的酶量定義為一個酶活力單位，U。

羰基還原酶活力以比酶活(U/g)表示，計算見式(1)。

(1)

式中：ρs為產物(13R,17S)-乙基仲醇質量濃度，g/L；Mp為產物摩爾質量，g/mol；V為反應液體積，L；X為菌體干質量，g；t為轉化時間，min。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基單因素實驗優化結果

2.1.1 碳源種類及濃度對菌體生長和產酶的影響

在微生物生長過程中，培養基中的碳源對細胞生長、代謝物產生起著重要作用。為考察碳源對菌株C.saturnusZJPH1807生長和產酶的影響，分別以質量濃度為15 g/L的葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)、甘油(glycerol)和可溶性淀粉(starch)替代初始發酵培養基中的碳源，結果見圖2。由圖2可知，采用以葡萄糖為碳源的培養基時，菌體所產酶的比酶活達到最大值0.08 U/g，此時生物量為5.05 g/L，這是因為葡萄糖易于被微生物菌體吸收利用，利于產酶，且葡萄糖成本相對較低。

圖2 碳源種類對菌體生長和產酶的影響Fig.2 Effects of various carbon sources on cell growth and enzyme production

繼而考察葡萄糖質量濃度對菌體生長和產酶的影響，結果如圖3所示。由圖3可知：當葡萄糖質量濃度為35 g/L時，所得生物量和酶活力達到最大；繼續增加葡萄糖濃度造成生物量和酶活力的降低，這可能是由于葡萄糖濃度過高導致C.saturnusZJPH1807因高滲透壓而失水，發生細胞的質壁分離，從而抑制其正常生長。因此選擇35 g/L為發酵培養基中葡萄糖的最佳添加量。

圖3 葡萄糖質量濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on cell growth and enzyme production

2.1.2 氮源種類及添加量對菌體生長和產酶的影響

微生物生長和產物合成都需要利用氮源，主要用于氨基酸、蛋白質、核酸等和含氮代謝物的合成。在確定最優碳源的基礎上，分別將質量濃度為20 g/L的蛋白胨(peptone)、酵母膏(yeast extract)、牛肉膏(beef extract)、黃豆粉(soybean)、玉米漿(CSL)、NH4Cl和(NH4)2SO4加至培養基中，替代初始發酵培養基中的氮源，結果見圖4。由圖4可知：當以酵母膏為有機氮源時，比酶活達最大值0.12 U/g；NH4Cl為無機氮源，最利于菌體生長，生物量達5.93 g/L。

圖4 氮源種類對菌體生長和產酶的影響Fig.4 Effects of various nitrogen sources on cell growth and enzyme production

由于NH4Cl可能會減輕代謝產物的抑制作用，酵母膏可提供產酶所需微量元素和生長促進因子[22]，故選擇酵母膏和NH4Cl作為菌株生長和產酶所需的復合氮源，同時還對酵母膏和NH4Cl的添加量進行了優化，結果見圖5～6。由圖5～6可知，最佳酵母膏添加量為15 g/L，生物量和比酶活分別為5.93 g/L和0.174 U/g。在此基礎下優化NH4Cl添加量，最終確定酵母膏和NH4Cl的最佳質量濃度分別為15和30 g/L。

圖5 酵母膏質量濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.5 Effects of yeast extract concentration on cell growth and enzyme production

圖6 NH4Cl質量濃度對菌體生長和產酶的影響Fig.6 Effects of NH4Cl concentration on enzyme production and cell growth

2.1.3 無機鹽種類對菌體生長和產酶的影響

無機鹽可調節微生物生長環境的滲透壓、pH和氧化還原電位，是微生物生命活動中不可或缺的成分。分別將1 g/L的KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl和1 mmol/L CaCl2、CuCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、FeCl3、MnCl2·4H2O和ZnCl2加至含最適碳氮源的發酵培養基中，考察無機鹽種類對菌體產酶及生長的影響，結果見表1。由表1可知：當去除含最適碳氮源培養基中的K+后，菌體比酶活明顯下降；培養基中添加CaCl2后菌體產酶和生長量都有所提高，其余金屬離子的添加均不同程度地抑制了C.saturnusZJPH1807的生長和產酶。磷是輔酶、蛋白質的主要成分，并且磷酸鹽也是發酵培養基中重要的緩沖鹽[23]，低濃度CaCl2可增強細胞膜的通透性。因此，發酵培養基中添加KH2PO4和CaCl2組分很有必要。

表1 無機鹽對菌體產酶和生長影響Table 1 Effects of inorganic salt on enzyme activity and cell growth

2.1.4 KH2PO4對菌體產酶和生長的影響

適量無機鹽對菌體生長和產物合成有促進作用，過高濃度時則表現為抑制作用[24]，因此考察不同KH2PO4質量濃度對菌株C.saturnusZJPH1807產酶和生長的影響，結果見圖7。由圖7可知：當KH2PO4質量濃度為1.0 g/L時，菌體生長和產酶均達到最佳，分別為6.13 g/L和0.27 U/g；繼續增加KH2PO4質量濃度，生物量緩慢下降，但比酶活出現明顯下降。由此可見KH2PO4最適加量為1.0 g/L。

圖7 KH2PO4質量濃度對菌體產酶和生長影響Fig.7 Effects of KH2PO4 concentration on enzyme production and cell growth

2.2 響應面優化Cyberlindnera saturnus ZJPH1807發酵培養基組成

根據單因素試驗結果，選取葡萄糖(A)、酵母膏(B)、NH4Cl(C)、KH2PO4(D) 這4個主要影響因素，以CyberlindnerasaturnusZJPH1807產酶能力為響應值，進行4因素3水平的響應面實驗，以獲得最大比酶活，具體設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of response surface experiment

所得二次回歸方程為Y=29.94-0.68A-0.12B+0.27C+0.23D-0.27AB+0.075AC+0.5AD+0.1BC-0.25BD-1.05CD-2.55A2-1.99B2-1.74C2-1.93D2

方差分析如表3所示。由表3可知，模型擬合系數R2=0.961 5，P值小于0.000 1，表明模型顯著，變異系數(CV)為0.778 0，進一步說明該模型可信，可用于分析實驗結果。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Significance test and analysis of variance of regression model

圖8為各因素間相互影響曲線圖。由圖8可知：葡萄糖、酵母膏、NH4Cl和KH2PO4這4個因素之間交互作用明顯，且均有最大值。最佳培養基組成為：葡萄糖34.36 g/L、酵母膏14.89 g/L、NH4Cl 30.34 g/L、KH2PO41.01 g/L，此時比酶活為0.27 U/g。

圖8 各因素相互作用對菌體產酶影響的3D響應面圖Fig.8 3D response surface plots of the effects of various factors on the enzyme activity of strain

2.3 驗證實驗

為驗證模型分析結果的準確性，在優化條件下進行了3批次驗證實驗，比酶活分別為0.27、0.26和 0.28 U/g，平均值為0.27 U/g。該模型較好地預測了菌株的產酶能力。

同時考察培養基優化前后對C.saturnusZJPH1807菌株生長和產羰基還原酶的影響，結果如圖9所示。由圖9可知，隨著發酵時間的延長，菌株C.saturnusZJPH1807生物量和比酶活均有所增加，采用優化后的發酵培養基時，其菌株生物量和酶活均優于初始發酵培養基，結果表明采用單因素和響應面法對發酵培養基關鍵因素進行優化可有效促進菌株C.saturnusZJPH1807的生長和產酶能力。

圖9 發酵培養基優化前后C.saturnus ZJPH1807菌株的生長和產酶過程曲線Fig.9 Growth and enzyme production curves of C.saturnus ZJPH1807 in fermentation medium before and after optimization

3 結論

利用C.saturnusZJPH1807菌株可高選擇性還原乙基二酮制備(13R,17S)-乙基仲醇。通過單因素與響應面實驗對發酵培養基中關鍵組分及其配比進行優化，獲得最佳培養基組成(g/L)：葡萄糖34.36、酵母膏14.89、NH4Cl 30.34、KH2PO41.01。采用此優化發酵培養基進行細胞產酶培養后用于生物不對稱還原，加入16 mmol/L乙基二酮后轉化12 h，(13R,17S)-乙基仲醇產率達75%，e.e.>99.9%，表明菌株CyberlindnerasaturnusZJPH1807具有應用于生物轉化法制備(13R,17S)-乙基仲醇的潛力，可為左炔諾孕酮藥物制備提供一條新工藝。