基于核磁共振飽和轉移差譜技術篩選Protein A仿生多肽配基

王偉穎，葛 佳，蘇志國，馬光輝，鄭永祥，郝冬霞，余 蓉

(1. 四川大學 華西藥學院 靶向藥物及釋藥系統教育部重點實驗室，四川 成都 610041; 2. 中國科學院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190; 3. 中國科學院大學，北京 100049)

工業上，常常使用Protein A親和層析技術純化抗體，但Protein A親和介質具有價格昂貴、易從基質上脫落及使用壽命短等缺陷[1-2]，而抗體多肽親和配基具有價格低廉、化學性質穩定的優勢[3]，因此開發抗體親和性多肽以取代Protein A親和介質是非常熱門的研究課題。目前對于抗體親和性多肽的開發和篩選多采用噬菌體展示[4-5]、組合化學庫[6]和分子模擬等技術手段[7]，這些方法具有篩選周期長、篩選范圍大、無法真實反映溶液中配基與蛋白相互作用的缺陷。

核磁共振飽和轉移差異差譜(STD-NMR)技術可以用于在溶液狀態下篩選能與大分子蛋白結合的小分子配基，并且可以通過表位分析確定小分子配基上與蛋白結合的關鍵位點信息[8-11]。因此，本文中，筆者以Protein A為目標，通過定向設計Protein A仿生多肽片段，利用STD-NMR技術在真實色譜環境下篩選能與抗體結合的多肽配基，在原子水平上評價多肽與抗體的結合機制，并將篩選到的多肽配基固定在瓊脂糖基質上制備出多肽介質，通過靜態吸附試驗評價篩選出的多肽配基結合抗體的能力。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

600 MHz液體核磁共振光譜儀(低溫探頭)，布魯克公司；752型紫外分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ZKSY型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪儀器廠；XSE104型電子分析天平，Mettler Toledo公司；PHS-220B型pH計，上海三信儀器有限公司。

多肽配基(95%純度)，吉爾生化(上海)有限公司；人抗體 (hIgG，95%純度)，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA,98%純度)，北京欣經科生物制品有限公司；重水(D2O)，Cambridge Isotope Laboratories Inc.；瓊脂糖微球Sepharose 4FF，美國GE Healthcare公司；其他化學試劑均為市售分析純。

1.2 STD-NMR實驗

所有的STD-NMR實驗均在25 ℃、脈沖序列為“STDDIFFGP19.3”的條件下進行，并且使用WATERSUP進行水峰的壓制。本實驗用的緩沖液為20 mmol/L磷酸緩沖液，溶劑是重水(D2O)，不同多肽配基溶解在上述的磷酸緩沖液中，配基的終濃度為1.25 mmol/L，終體積為500 μL，在離心管中充分溶解后，轉移到直徑5 mm的核磁管中備用。

1.3 吸附等溫線的測定

采用環氧活化的方式將六肽FYEILH固定在瓊脂糖4FF微球上制備出六肽FYEILH親和介質[12]，將此親和介質依次用去離子水和結合緩沖液充分洗滌，抽干，然后稱取 20 mg抽干介質與 2.0 mL蛋白溶液(0.2～4.0 mg/mL，結合緩沖液溶解)混合，在25 ℃、140 r/min條件下吸附4 h后，將吸附體系在4 000 r/min條件下離心5 min 后收集上清液，在280 nm處用紫外分光光度計測上清液的吸光值以確定上清液中蛋白質量濃度(ρ)，進而根據物料守恒原則即可確定配基的吸附容量(式(1))，然后應用 Langmuir 模型(式(2))描述吸附等溫線，確定配基的飽和吸附載量qs和解離常數。

(1)

式中：q為吸附容量，mg/mL；ρ0為初始蛋白質量濃度，mg/mL；ρ為吸附平衡時上清液中蛋白質量濃度，mg/mL；Vl為吸附前加入蛋白的體積，mL；Vs為介質體積，mL。

(2)

式中：qm為飽和吸附載量，mg/mL；Kd為解離常數，mg/mL。

2 結果與討論

2.1 親和配基精準篩選技術的建立——照射位點的選擇

進行STD-NMR實驗時，需要選擇2個照射位點，其中一個為既遠離大分子又遠離小分子的非選擇性照射位點，另一個為只有大分子沒有小分子的選擇性照射位點，選擇性照射位點的最優化選擇是在沒有抗體存在時，單獨配基溶液不會產生STD信號，以防產生假陽性的實驗結果。由于本研究中使用的多肽配基信號比較廣泛，且不同肽段的氨基酸組成不同，質子的化學偏移也不同，因此，為了排除因照射位點的選擇不當而引起的假陽性，需要對照射位點進行一系列的優化。

圖1顯示了不同長度、不同氨基酸組成的多肽在不同選擇性照射位點下的STD圖譜，并將這些多肽在不同選擇性照射位點下呈現的陽性和假陽性的實驗結果列于表1中。由圖1和表1可知，不同長度、不同組成的多肽有自身的適宜的選擇性照射位點，從照射位點的優化結果可以看出，最佳選擇性照射位點的位置不僅與多肽配基的長短有關，也與配基質子的化學位移δ有關。因此在選擇照射位點的位置時，其與配基質子之間的距離(δ)至少為1；對于大于6個氨基酸的多肽，其選擇性照射位點的位置與配基質子之間的距離δ要大于1。此外，選擇性照射位點的位置在滿足不會使多肽配基產生假陽性的基礎上，還應該盡可能靠近大分子蛋白的位置，同時由于抗體在δ為1處仍然具有質子信號，所以，在本文中選擇的選擇性照射位點的位置多在δ為1處。

A～E—多肽在不同選擇性照射位點下的STD圖譜；F—多肽的氫譜1H NMR圖1 不同多肽的核磁共振譜圖Fig.1 1H NMR spectra of the peptides of different lengths

表1 各種肽段的陽性和假陽性位點Table 1 Positive and false positive selective irradiation for various peptides

2.2 Protein A仿生多肽親和配基的設計和篩選

晶體衍射結果表明Protein A主要通過其前2個螺旋與抗體結合[13-14]，因此根據Protein A的 domain B前2個α螺旋上的氨基酸組成進行定向設計，分別合成了KEQQNA、FYEILH、EEQRNG和FIQSLKD這4個肽段(圖2)。將STD-NMR技術用于檢測這些肽段與抗體的結合能力，并用STD factor來評價肽段和抗體的親和力強弱(STD factor=ISTD/Io×Eligand。其中，ISTD指的是STD譜上與抗體結合的配基質子的信號強度，Io是off譜上對應的配基質子的信號強度，Eligand是配基與抗體的濃度比，在本實驗中使用的配基與抗體的濃度比為100)，STD factor值越大表明配基與抗體的親和性越強。圖3(a)顯示了合成的4個多肽配基在不同pH條件下與抗體結合的STD factor值，從實驗結果可以發現六肽FYEILH在pH 6.0條件下與抗體親和性最強，大于其余多肽在各個pH下的結合強度。圖3(b)展示了六肽FYEILH與文獻中報道的具有最高載量多肽配基YFRH與抗體結合STD factor的值的比較，結果顯示六肽FYEILH與抗體的親和性高于目前文獻中報道的具有最高載量多肽配基YFRH。由此可見，多肽FYEILH具有發展成為抗體親和配基的潛力。

圖2 Protein A的B結構域的氨基酸序列和SpA-hIgG1 復合物的初始構象(PDB：1FC2)Fig.2 Sequence alignment of domain B of Protein A and initial conformation of the SpA-hIgG1 complex (PDB:1FC2)

圖3 Protein A上4個多肽配基在不同pH條件下STD factor及四肽YFRH和六肽FYEILH的抗體親和性Fig.3 STD factor of four peptides from Protein A at different pH,and the binding capacity between YFRH-hIgG and FYEILH-hIgG

2.3 仿生多肽親和配基與抗體結合機制的探究

STD-NMR技術中的重要參數STD effect (ISTD/I0)能夠在原子水平上考察多肽配基與抗體結合的關鍵位點信息。STD effect值代表了多肽上不同質子距離抗體的遠近，STD effect值越大，表明質子與抗體距離越近，與抗體的親和力越強，其在多肽與抗體的結合中發揮著越重要的作用，當某一質子的STD effect大于10%時，則表明該質子與抗體具有明顯的相互作用[10]。圖4為六肽KEQQNA的結構式以及其與抗體反應后的STD圖譜。由圖4可知：六肽KEQQNA上的賴氨酸(K)側鏈的ε質子具有最大的STD effect值，表明賴氨酸(K)側鏈中的氨基通過靜電作用與抗體結合；除此之外，位于丙氨酸(A)側鏈的脂肪族質子，與抗體也具有相對較近的距離(STD effect為25%)，其通過疏水作用參與與抗體的結合。由此可知，六肽KEQQNA在與抗體的相互作用中占主導地位的為靜電相互作用，其次為疏水相互作用。

圖4 六肽KEQQNA的結構及其與抗體反應的STD圖譜Fig.4 Structural formula of hexapeptide KEQQNA and 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of KEQQNA in the presence of human IgG

圖5為六肽FYEILH的結構式以及其與抗體反應后的STD圖譜。由圖5可知：六肽FYEILH中谷氨酸(E)側鏈羧基的質子具有最大的STD effect值，表明谷氨酸(E)側鏈羧基通過靜電作用主導六肽FYEILH與抗體的結合；除此之外，亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)以及酪氨酸(Y)上的脂肪族和芳香族質子與抗體也具有相對較近的距離，其通過疏水作用參與與抗體的結合。由此可知，六肽FYEILH在與抗體的相互作用中占主導地位的為靜電相互作用，其次為疏水相互作用。

圖6為六肽EEQRNG的結構式以及其與抗體反應后的STD圖譜。由圖6可知：六肽EEQRNG中的精氨酸(R)側鏈的δ質子具有最大的STD effect值，表明六肽EEQRNG與抗體的結合主要是由精氨酸(R)側鏈上的氨基通過靜電相互作用和氫鍵驅動的；此外，位于甘氨酸(G)上的質子與抗體也具有相對較近的距離(STD effect為63%)，其通過疏水作用參與與抗體的結合。由此可知，六肽EEQRNG在與抗體的相互作用中占主導地位的為靜電相互作用和氫鍵，其次為疏水相互作用。

圖6 六肽EEQRNG結構及其與抗體反應的STD圖譜Fig.6 Structural formula of hexapeptide EEQRNG and 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of EEQRNG in the presence of human IgG

圖7為七肽FIQSLKD的結構式以及其與抗體反應后的STD圖譜。由圖7可知： FIQSLKD中絲氨酸(S)β位上的質子具有最大的STD effect值，表明絲氨酸(S)側鏈通過氫鍵和疏水作用與抗體結合；除此之外，位于異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、賴氨酸(K)和亮氨酸(L)上的脂肪族和芳香族質子與抗體也具有相對較近的距離，其通過疏水作用參與與抗體的結合。由此可知，FIQSLKD與抗體結合的主要驅動力為氫鍵和疏水相互作用。

圖7 七肽FIQSLKD的結構及其與抗體反應的STD圖譜Fig.7 Structural formula of heptapeptide FIQSLKD 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of FIQSLKD in the presence of human IgG

表2總結了上述利用STD-NMR技術確定的Protein A上4個肽段KEQQNA、FYEILH、EEQRNG和FYEILH與抗體相互作用的關鍵位點，以及這些關鍵位點與文獻[14]中利用晶體衍射確定的Protein A上與抗體結合的熱點殘基。

由表2可知，利用STD-NMR技術和晶體衍射技術確定的關鍵結合位點大部分能吻合，但在個別位點上有差異。這表明晶體狀態與溶液狀態中受體和配體的相互作用存在差異，周圍氨基酸的調控作用和構象差異能夠影響配體和受體的相互作用位點。

表2 仿生肽配基與抗體結合位點的比較Table 2 Comparison of the residues of biomimetic peptide binding to antibody

2.4 靜態吸附實驗驗證六肽FYEILH結合抗體的能力

圖8展示了利用Langmuir 模型擬合獲得的FYEILH的靜態吸附曲線。由圖8數據的擬合結果可知，此多肽介質結合抗體的靜態吸附容量(qm)為61.22 mg/mL，與抗體的親和力為0.8×10-6mol/L。表3展示了六肽FYEILH與參考文獻中有代表性的抗體親和配基的靜態載量和表觀解離常數。由表3可以發現，文獻中報道的多數多肽配基與抗體的親和力即Kd為10-5～10-6mol/L，本研究中筆者篩選出的六肽FYEILH與抗體的結合的解離常數Kd為0.8×10-6mol/L，說明它與抗體的親和性強于文獻報道的許多多肽配基，雖然此親和力仍然弱于Protein A與抗體的親和力，但這種較弱的親和力反而有利于結合在配基上的抗體在更溫和的條件下被洗脫，從而有效地避免使用強酸或強堿性洗脫造成的配基脫落和抗體變性聚集。此外，在未來的研究中，還可以通過提高配基密度或連接間隔臂來固定配基的方式進一步提高多肽結合抗體的容量[12,20]。

圖8 FYEILH親和介質和空白介質對 hIgG 的吸附等溫線(pH 6.0)Fig.8 Adsorption isotherm of hIgG onto the FYEILH peptide resins and blank resins at pH 6.0

表3 FYEILH、HWRGWV、DWHW、FYWHCLDE、Protein A、CVFYRNGKSFQFS和PG8表觀解離常數(Kd)和靜態載量(qm)Table 3 Comparison of the capacity (qm) and apparent dissociation constant(Kd) of FYEILH,HWRGWV,DWHW,FYWHCLDE,Protein A,CVFYRNGKSFQFS and PG8

3 結論

在本研究中，定向設計了Protein A上能與抗體結合的4個仿生肽段，利用STD-NMR技術表征了這些肽段與抗體結合的關鍵位點，與利用X線晶體衍射確定的Protein A上與抗體結合的關鍵位點信息進行比較，發現兩者確定的關鍵位點信息基本吻合。

將篩選到與抗體親和性最強的六肽固定在固體基質上制備出了六肽介質，此介質與抗體的親和性達到0.8×10-6mol/L、靜態吸附容量為61.22 mg/mL。由此可見，通過對Protein A定向設計，將其最小化獲得的六肽FYEILH與抗體具有較高的親和性。本研究為開發其他用于純化的功能性大蛋白質的最小化多肽配基提供了思路和方法。