脂肪醇氧化酶基因缺失對熱帶假絲酵母生理功能的影響

張海冰，張利華，陳獻忠，沈 微，樊 游

(江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

熱帶假絲酵母是一種具有工業價值的非常規二倍體酵母，可以利用烷烴、脂肪酸等非常規物質為唯一碳源進行生長[1-2]。目前，人們主要利用熱帶假絲酵母合成長鏈二元酸并實現了工業規模化的生產[3-5]。當熱帶假絲酵母以烷烴為底物時，烷烴進入細胞后首先在微粒體中被細胞色素P450(CYP)與NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)共同催化，進行α-氧化，進而生成脂肪醇；隨后，脂肪醇被轉運至細胞質中，然后在脂肪醇氧化酶(FAO)或脂肪醇脫氫酶(ADH)、脂肪醛脫氫酶(FALDH)的催化作用下依次氧化成脂肪醛、脂肪酸。極少量的一元脂肪酸被分泌到細胞外，大部分的一元脂肪酸會再次轉運至微粒體中，在相同的酶系催化作用下進行ω-氧化，最終生成α,ω-二羧酸[6-7]。

目前，針對ω-氧化途徑相關的酶基因已經有了一些研究。Craft等[8]從熱帶假絲酵母中克隆并鑒定10個CYP基因，并且發現不同的CYP存在底物特異性，可作為改造ω-氧化途徑的潛在靶點。Dickinson等[9]鑒定FAO為膜結合型黃素蛋白，并且對光敏感，以十二醇為底物進行動力學研究發現FAO催化反應符合乒乓機制。Eirich等[10]從熱帶假絲酵母ATCC 20336克隆了4個FAO基因，分別為2個FAO1、FAO2a和FAO2b，并將其在大腸桿菌進行外源表達，進一步研究發現FAO1只負責ω位碳原子氧化，而不能氧化β位碳原子，FAO2a和FAO2b的作用與FAO1相反。Cheng等[11]以熱帶假絲酵母ATCC 750為出發菌株，構建了FAOT等位基因雙缺失的菌株，無法檢測到FAOT酶活，并且細胞代謝烷烴受到很大影響。Lu等[12]累加敲除了4個FAO基因和其他12個相關基因，成功構建了利用肉豆蔻酸甲酯為底物發酵生產ω-羥基脂肪酸的菌株。王澤政等[13]從熱帶假絲酵母中鑒定脂肪醛脫氫酶基因并將其在大腸桿菌中異源表達，研究了相應的酶學性質，在此基礎上敲除了2對CtAld基因后發現，突變株合成長鏈二元酸的能力顯著下降。然而，FAO基因對熱帶假絲酵母細胞的碳源利用、細胞生長和代謝產物積累等生理功能影響還未見研究報道。

圖1 烷烴在熱帶假絲酵母中代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of alkanes in C. tropicalis

本研究中，筆者通過對熱帶假絲酵母ATCC 20336菌株的FAO基因進行敲除及回補，構建了3株基因突變菌株和2株基因回補菌株，分析了不同菌株在不同碳源中的生長情況及胞內酶活變化，并將突變菌株以烷烴為底物進行發酵，考察了突變株轉化烷烴合成脂肪醇的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

實驗所用菌株見表1，U-204是由熱帶假絲酵母ATCC 20336使用CRISPR/Cas9基因編輯系統構建；質粒Tm-gda324-URA3、Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3均由筆者所在實驗室保藏；pMD19-T Simple載體，TaKaRa公司；PCR引物，蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成(表2)。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑與儀器

正十二烷醇(色譜級)、正十四烷醇(色譜級)、正己烷(色譜級)、正十二烷、正十三烷、正十四烷，阿拉丁試劑公司；酵母氮基(YNB)、5-氟乳清酸(5-FOA)，生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ATBS)，Sigma公司；一步克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit)，南京諾唯贊生物科技有限公司。

UV-2100型可見分光光度計，上海尤尼科有限公司；PCR擴增儀，上海東勝興業科學儀器有限公司；ISQ單四級桿氣質聯用儀、高速臺式離心機，賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 主要培養基

LB培養基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0。

MM培養基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0。

SM培養基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06。

5-氟乳清酸(5-FOA)培養基：在SM培養基的基礎上添加2 g/L 5-FOA。

C+培養基(g/L)：YNB 6.7、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06；根據需要加入2%(體積分數)正十二烷、正十三烷或正十四烷。

YPD培養基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、蛋白胨20.0。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、YNB 6.7、酵母粉6.0、蛋白胨3.0、K2HPO47.2、KH2PO49.3；若配制固體培養基,則再加入20.0 g/L瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 敲除盒構建

對熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組進行分析，獲得2對FAO等位基因，分別為FAO1(FAO11和FAO12)、FAO2(FAO2a和FAO2b)基因，根據基因序列構建敲除盒。以基因FAO11敲除盒構建為例，設計引物FAO11-F和FAO11-R，以熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組為模板，PCR擴增FAO11基因，經PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple 載體進行連接，獲得重組質粒Ts-FAO11；以質粒Ts-FAO11為模板，設計引物rFAO11-F和rFAO11-R(分別添加PstⅠ 和XbaⅠ 酶切位點)，反向PCR得到片段FAO11U-Ts-FAO11D，凝膠回收該片段，將該片段與質粒Tm-gda324-URA3同時經限制性內切酶PstⅠ和XbaⅠ 消化，再凝膠回收后將片段FAO11U-Ts-FAO11D與片段gda324-URA3連接，獲得重組質粒Ts-FAO11-gda324-URA3。以上述重組質粒為模板，用引物FAO11-F和FAO11-R，PCR得到敲除盒FAO11U-gda324-URA3-FAO11D(圖2)。利用相似策略，構建其他基因敲除盒，所用引物見表2。

圖2 重組質粒Ts-FAO11-gda324-URA3構建過程Fig.2 Construction of FAO11 disruption plasmid Ts-FAO11-gda324-URA3

1.2.2 脂肪醇氧化酶基因敲除過程

將敲除盒轉入熱帶假絲酵母采用LiCl轉化法[14]。以尿嘧啶缺陷型菌株U-204為出發菌株，以URA3基因為篩選標記，將敲除盒轉入宿主內，接著涂布到MM固體培養基挑取轉化子，提取基因組，PCR驗證鑒定出正確轉化子；將上步正確的轉化子涂布到5-FOA培養基，再次挑選轉化子，提取基因組，PCR初步驗證彈出URA3基因后，將PCR產物送至公司測序，序列比對無誤后保藏正確菌株；此方法可以重復利用篩選標記[15-16]。以FAO1基因敲除過程為例,具體敲除過程見圖3。

圖3 熱帶假絲酵母FAO1基因敲除流程Fig.3 Sequential gene disruption of FAO1 in C. tropicalis

1.2.3 脂肪醇氧化酶基因回補實驗

以FAO11基因表達為例描述具體的實驗過程。以熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組為模板，使用引物SFAO11-F和SFAO11-R進行PCR擴增，得到FAO11基因的啟動子、結構基因和終止子，驗證正確并純化后，通過一步克隆法將線性化的質粒Ts-CAT1-gda324-URA3、FAO11基因啟動子、結構基因和終止子連接起來，得到重組質粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11。重組質粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a與上述構建步驟一致。使用引物CAT1-F和CAT1-R或引物CAT2-F和CAT2-R，以相應的質粒為模板進行PCR擴增，產物純化后構建質粒后導入酵母轉化，兩者的轉化宿主分別為FTYT和2aT2bT菌株。

1.2.4 酵母細胞在不同碳源的生長情況

將各菌株在平板上劃線培養，挑取單菌落轉接到SM培養基，取適量菌液轉接到C+培養基中，初始OD600控制在0.10～0.15，每株菌3個生物學平行，每隔8 h或12 h測量一次OD600，84 h時測量結束并繪制生長曲線。

1.2.5 脂肪醇氧化酶酶活測定

酶活測定方法在文獻[10]的基礎上有所改動。將單菌落在SM培養基培養2 d后轉接入新鮮SM培養基，加入2%(體積分數)十二烷培養2 d后取20 mL菌液離心收集菌體，用50 mmol/L HEPES緩沖液洗滌2次后將菌體在ST緩沖液(細胞壁水解酶lyticase 緩沖液)中重新懸浮，并添加酵母細胞壁水解酶至60 U/mL，于30 ℃金屬浴1 h，每隔20 min上下倒置混勻1次。5 000 r/min離心10 min收集原生質體，用K3PO4緩沖液洗滌2次，最后重懸在5 mL K3PO4-甘油緩沖液中，使用超聲波破碎儀對細胞進行破碎，總時長30 min，然后將細胞破碎液在4 ℃下37 000 r/min離心30 min，取上清液在4 ℃、100 000 r/min條件下離心1 h收集微粒體后，加入適量K3PO4-甘油緩沖液溶解微粒體后在-20 ℃下保藏，溶解液用作粗酶液，用Bradford法(考馬斯亮藍法)測定粗酶液中的總蛋白含量。

最終的反應混合物由500 μL的200 mmol/L HEPES緩沖液、50 μL的10 mg/mL ATBS溶液、10 μL的5 mmol/L十二烷醇溶液和5 μL的HRP溶液組成。不同量的細胞提取物加入反應體系，補加去離子水至1 mL。脂肪醇氧化酶酶活測定在分光光度計405 nm處，在室溫下進行測量。1個酶活單位(U)定義為1 min氧化1 μmol底物所需的酶量。對以1 mmol/L ABTS+·在405 nm處的消光系數為18.4折算，相當于0.5 mmol/L氧化底物。

1.2.6 搖瓶發酵實驗

將菌株U-204、FTYT、2aT2bT和F3YT在平板上劃線培養，挑取單菌落轉接到SM培養基，200 r/min、30 ℃培養2 d后，再以1%(體積分數)接種量轉接到SM液體培養基，同時加入2%(體積分數)正十二烷培養2 d后，以10%接種量轉接到發酵培養基中，同時加入2%正十二烷200 r/min、30 ℃培養，每株菌3個生物學平行。發酵開始后，0～48 h用2 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4調pH至5.5～6.0；48 h后每隔12 h調pH至7.5～8.0，每隔24 h補加2.5%(體積分數)甘油(50%)，培養72 h時補加2%正十二烷，發酵周期為160 h。

1.2.7 發酵產物中脂肪醇的檢測

標準品配制。準確稱取正十二烷醇和正十四烷醇各30 mg，將兩者溶解于色譜級正己烷中，配制成終質量濃度為30 mg/L的標準品。

M為標準DNA。圖4(a):1～4—質粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3雙酶切的結果。圖4(b):1～4—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO11-gda324 -URA3為模板，FAO11-F和FAO11-R為引物的PCR結果;5～8—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO12-gda324-URA3為模板，FAO12-F和FAO12-R為引物的PCR結果。圖4(c):1～4—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2a-gda324-URA3為模板，FAO2a-F和FAO2a-R為引物的PCR結果； 5～8—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2b-gda324-URA3為模板，FAO2b-F和FAO2b-R為引物的PCR結果圖4 脂肪醇氧化酶基因敲除菌株的構建Fig.4 Disruption of the FAO1 or FAO2 genes disruption in C. tropicalis

發酵液處理方法。取5 mL發酵液于離心管中，同時加入正十四烷醇作為內標，煮沸加熱15 min用來破碎細胞，隨后加入10 mL色譜級正己烷渦旋振蕩15 min萃取目的產物，12 000 r/min離心5 min，取上層液體1 mL于2 mL進樣瓶中，最后通過氣質聯用儀檢測發酵產物[18-19]。

氣質聯用檢測方法。①色譜條件為TG-WAXMS氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速為1 mL/min,升溫程序：50 ℃保持1 min后，以10 ℃/min速度上升至230 ℃，保持15 min。②質譜條件為傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度260 ℃，EI離子源，電子能量70 eV，掃描方式采用EI全掃描。

2 結果與討論

2.1 脂肪醇氧化酶基因突變株的構建

構建FAO1和FAO2基因敲除盒質粒，用限制性內切酶PstⅠ和XbaⅠ雙酶切分別驗證質粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3結果見圖4(a)。理論上預期片段大小依次為3 504和1 923 bp、3 226和1 923 bp、3 500和1 923 bp以及3 486 bp和1 923 bp的兩條帶。由圖4(a)可知，PCR驗證的條帶上的1～4，與理論預期的大小一致，將它們再送至公司測序驗證，表明4個FAO基因敲除質粒構建成功。

用上述重組質粒為模板，PCR擴增出相應的敲除盒，將其轉入宿主中，挑取轉化子，并提取基因組，使用對應同源臂上下游引物進行驗證，結果見圖4(b)～(c)。理論上應擴增出2 565、2 547、2 718和2 704 bp的條帶。圖4(b)和(c)的條帶1和5的結果與理論預期值一致，表明敲除了FAO1基因和FAO2基因；將轉化子彈出URA3基因后再依次用上述引物擴增，理論上應擴增出980、870、1 132和1 118 bp，圖4(b)和(c)的條帶2和6的結果與理論預期值一致；圖4(b)和(c)的條帶3與7是以相應的出發菌株為對照，4與8泳道是以相應的敲除質粒為對照。將圖4(b)和(c)中相關泳道的PCR產物純化后進行DNA測序，結果顯示成功構建了菌株FTYT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324)、2aT2bT(ura3/ura3fao2a::gda324fao2b::gda324)和F3YT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324fao2a::gda324fao2b::gda324)。

2.2 脂肪醇氧化酶基因的回補表達

將構建的重組質粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11和Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a送至公司測序，驗證正確無誤后，用上述重組質粒為模板，PCR擴增出相應的表達盒，將其轉入相應宿主中，挑取轉化子，并提取基因組；使用對應的同源臂上下游引物進行驗證，結果見圖5。理論上應擴增出6 389和5 960 bp的條帶。由圖5可知，條帶1和4對應的結果與理論預期值一致。條帶2與5是以相應表達質粒為對照，條帶3與5是以相應出發菌株為對照，由于整合位點是等位基因，因此1和4泳道會存在和3和6泳道對應的條帶。將圖5相關泳道的PCR產物送至公司進行測序，結果顯示成功構建了UCF1和UCF2菌株。

M—標準DNA; 1～3—以菌株UCF1、FTYT和質粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11為模板， CAT1-F和CAT1-R為引物的PCR 結果; 4～6—以菌株UCF2、2aT2bT和質粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a，CAT2-F和CAT2-R為引物的PCR 結果圖5 脂肪醇氧化酶基因回補Fig.5 Complementation of fatty alcohol oxidase genes

2.3 突變株在不同碳源條件下的生長情況

考察各菌株在不同碳源條件下的生長情況，來分析FAO基因缺失對菌株利用碳源的影響，結果見圖6。由圖6可知：當以葡萄糖為唯一碳源時，各菌株生長情況并無明顯差異；當以烷烴(C12～C14)為唯一碳源時，各菌株的延滯期變長，并且生長情況出現顯著差異，敲除FAO1基因的FTYT菌株生長速度快于U-204菌株，而敲除FAO2a和FAO2b基因的2aT2bT突變株和組合敲除4個基因的F3YT菌株生長都受到明顯抑制，且F3YT只表現出極微弱的生長；菌株UCF1(FTYT菌株回補FAO11基因)和UCF2(2aT2bT菌株回補FAO2a基因)回補基因后與出發菌株生長情況無顯著差異。在烷烴培養基上，雖然FAO1基因敲除促進菌株生長，FAO2基因敲除抑制菌株生長，但是兩個基因同時敲除菌株卻幾乎不生長，這也說明了FAO2基因在烷烴代謝過程中扮演著更為重要的角色。

圖6 不同碳源的對菌株生長的影響Fig.6 Effects of carbon sources on strain growth

值得注意的是，當FAO1基因敲除后，突變株生長速度快于出發菌株，這是很有趣的結果。有研究表明，熱帶假絲酵母中細胞色素P450家族中的CYP52A17也可以直接氧化脂肪醇[20]，由此推測敲除FAO1導致ω氧化途徑中其他酶解除抑制，從而加速烷烴的利用。總之，敲除FAO基因敲除會影響細胞利用烷烴，FAO1基因的敲除可促進細胞利用烷烴生長，FAO2基因的敲除卻抑制細胞利用烷烴生長，這表明FAO1和FAO2基因的功能存在差異。

2.4 FAO基因缺失對菌株十二烷醇氧化酶酶活的影響

以正十二烷醇為底物檢測脂肪醇氧化酶酶活，結果見圖7。由圖7可知：出發菌株的比酶活比各基因突變株明顯要高，說明FAO1基因的缺失導致脂肪醇氧化酶的酶活顯著下降，比U-204菌株下降近79%；FAO2基因缺失后的菌株脂肪醇氧化酶酶活性損失僅為U-204菌株的37.5%；組合敲除FAO1和FAO2基因后，菌株F3YT中的脂肪醇氧化酶比酶活比FTYT菌株的又一次降低，與U-204菌株相比降低近89%，這表明FAO1與FAO2之間存在差異，與不同菌株對碳源的利用結果一致。

圖7 十二烷誘導各菌株的比酶活Fig.7 Dodecane induces specific enzymeactivity of each strain

2.5 FAO基因缺失對菌株積累脂肪醇的影響

發酵結束后，將標準樣品和待測樣品同時采用氣質聯用儀檢測，結果見圖8。由圖8可知：正十二烷醇與正十四烷醇的保留時間相差2 min左右，兩峰互不干擾，目標產物的離子峰與預期的一致，并且與標準離子峰比較，鑒定物質為正十二烷醇和正十四烷醇。

圖8 氣質聯用分析發酵產物Fig.8 GC-MS analysis of products

通過計算得到各菌株積累的正十二烷醇含量，結果見圖9。由圖9可知：U-204菌株與2aT2bT菌株幾乎不積累正十二烷醇，分別為0.13和0.21 mg/L；FTYT菌株和F3YT菌株積累不同含量的正十二烷醇，分別為9.73和59.63 mg/L；與出發菌株相比，單獨敲除FAO1基因就可以積累少量正十二烷醇，單獨敲除FAO2基因幾乎不積累目標產物，同時敲除FAO1和FAO2基因導致正十二烷醇積累量顯著提高，是FTYT菌株的6倍左右，是出發菌株的近460倍。

圖9 FAO1和FAO2基因敲除對正十二烷醇積累的影響Fig.9 Effects of FAO1 and FAO2 genes disruption on 1-dodecanol production in C. tropicalis

當FAO2基因單獨敲除后，幾乎不積累目標產物，但在FAO1基因敲除的基礎上在敲除FAO2基因，目標產物產量得到顯著提升，這與前面研究的結果一致。脂肪醇到脂肪醛這一步的催化，還存在脂肪醇脫氫酶(ADH)負責脂肪醇的氧化，并且FAO與ADH基因在細胞內分布的位置不同，功能之間也存在差異[21-22]。目前微生物發酵法生產脂肪醇大多數是通過代謝工程改造大腸桿菌或酵母，以葡萄糖為底物合成脂肪醇[18,23]，而熱帶假絲酵母能夠利用烷烴合成二元酸，脂肪醇氧化酶FAO是二元酸合成途徑中催化脂肪醇到脂肪醛的關鍵酶，通過敲除脂肪醇氧化酶編碼基因FAO理論上能夠實現脂肪醇的積累，為脂肪醇的生產提供了一條新思路。本論文結果也證明了我們的推測，但脂肪醇的產量相對較低，依然有很大提升空間，可以在F3YT菌株的基礎上過表達相關CYP與CPR酶基因，同時敲除有關ADH基因來提升脂肪醇含量。綜上所述，FAO1基因和FAO2基因在細胞烷烴代謝中具有重要作用，基因缺失可導致菌株積累脂肪醇，可以將其作為代謝工程改造熱帶假絲酵母生產脂肪醇的潛在靶點。

3 結論

對熱帶假絲酵母ω-氧化途徑中的FAO基因進行敲除及回補，成功構建了不同突變菌株；選擇不同碳源考察缺失FAO基因后菌株的生長情況以及胞內相應酶活變化以及以烷烴為底物轉化脂肪醇的能力，獲得以下主要結論：

1)FAO基因在熱帶假絲酵母細胞烷烴代謝烷烴中具有重要作用，FAO1或FAO2基因缺失對細胞利用烷烴產生不同的影響，兩者功能存在差異。

2)FAO基因缺失可導致熱帶假絲酵母積累脂肪醇，F3YT菌株可以積累正十二烷醇59.63 mg/L，是出發菌株的近460倍。FAO基因可作為改造熱帶假絲酵母生產脂肪醇的潛在靶點。