基于磁蛋白標簽的黃曲霉毒素氧化酶的分離及應用

馬 萌,高 蓓,劉 瑤,方波歡,江 敏,朱 通,張增輝,張魯嘉

(1. 華東師范大學 化學與分子工程學院 上海分子治療與新藥創制工程技術研究中心，上海 200241; 2. 華東師范大學 物理與材料科學學院，上海 200241; 3.紐約大學(上海)計算化學中心，上海 200122; 4. 華東理工大學 生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

家鴿、候鳥,蝙蝠、鼴鼠,龍蝦,蝴蝶和果蠅等能探測到地球的磁場，通過這種能力，它們可以進行遷徙與定位[1-3]。近年來，科學家發現生物的遷徙、導航、定位行為與生物體內的磁蛋白有關，并提出了以磁蛋白為基礎的生物羅盤模型[4]。Qin等[4]認為在具有導航能力的動物體內，磁感應能力的基礎并不是人們一直以來認為的感藍光蛋白隱花色素(CRY)[5]，而是另外一種具有磁感應性的蛋白質，這種蛋白質與CRY形成蛋白復合物，共同決定著動物的歸巢與遷徙，所以他們將這類同動物磁感應機制相關的蛋白命名為磁受體蛋白(MagR)，該課題組從果蠅CG8198基因組中篩選出了這種磁感應受體蛋白(dMagR)，并采用一系列的細胞、生物化學實驗和生物物理學方法對其進行了表征，證實了MagR不僅可與CRY組成復合物，其單體也可組聚形成棒狀結構，對地磁等外界磁場有不同程度的響應，且MagR/CRY復合體的形成在果蠅、帝王蝶，家鴿，鼴鼠、小須鯨和人等物種中是保守的[4]。

蛋白的分離純化是其結構解析、性質測定及工業應用等研究的基礎。傳統的蛋白質分離標簽，如6×His-tag[6]、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)[7]及麥芽糖結合蛋白(MBP)[8]等，其分離過程依賴于較昂貴的分離純化柱，且進行蛋白質分離時步驟繁瑣、需配制多種溶劑以適應蛋白分離所需的環境、分離后需再置換溶液以適應后期的蛋白表征，給蛋白純化工作帶來諸多不便。

家鴿磁蛋白(clMagR)，其全長基因序列為396 bp，編碼132個氨基酸，分子量約為1.4×104[4]。基于clMagR具有超順磁性的性質，Jiang等[9]將clMagR作為蛋白融合標簽，與3種小分子量蛋白(～2.5×104)共表達，通過clMagR與Fe3O4的物理吸附，成功實現了目的蛋白的分離。該方法簡單有效，可一步獲得純度較高、酶活性良好、且具有較好耐受性的蛋白質。由此可見，與傳統方法相比，基于磁蛋白分離標簽的蛋白分離純化策略具有明顯的優勢。

雖然Jiang等[9]利用clMagR融合標簽對較小分子量的蛋白進行了分離純化及性質表征，目前，clMagR能否牽動分子量較大的蛋白，達到高效分離的效果還未驗證。黃曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO)是近年來發現的一種由假蜜環菌(Armillariellatabescens,E-20)分泌的蛋白[10]，分子量約7.5×104[11]，可以將黃曲霉毒素的主要毒性結構基礎——雙呋喃環的雙鍵打開，成為無毒性的物質[12]，因而具有顯著的去毒化作用。

本文中，筆者將黃曲霉毒素蛋白與磁蛋白共表達于大腸桿菌，并通過clMagR與Fe3O4的物理吸附，探索基于磁蛋白標簽的純化策略對于黃曲霉毒素蛋白的分離純化效果，進而研究其去毒化作用，同時也進一步開發磁蛋白標簽對于大分子量蛋白的純化能力。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、質粒和材料

pET-28a(+)、表達clMagR的E.coliDH5α菌株，華東理工大學江敏提供；pET-28a(+)-AFO質粒，上海睿勉生物工程公司商業合成；感受態宿主E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、TAE緩沖液，上海捷瑞生物工程公司；磁珠回收裝置，上海睿迪生物工程有限公司；質粒提取試劑盒與瓊脂糖凝膠回收試劑盒，慧晶生物科技股份有限公司；Taq酶、Prime STAR?Max DNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。磁珠(Beaver BeadsTMMagOH,10 mg/mL)，蘇州海貍生物醫學工程有限公司；黃曲霉毒素B1(AFB1)標準品、乙腈和甲醇皆為色譜純，Sigma公司。

LB液體培養基：蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 1 g，加超純水至總體積為100 mL;121 ℃滅菌20 min，室溫放置待用。

LB固體培養基即在液體培養基的基礎上加入使終質量濃度為15 g/L的瓊脂粉，121 ℃、20 min滅菌，常溫保存。

PBS緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO412.3 mL與0.2 mol/L NaH2PO487.7 mL混合至總體積100 mL；pH 6.0。

EGTA-PBS緩沖液：在前述pH為6.0的PBS緩沖液中加入終濃度為5 mmol/L的EGTA。

1 000×MgSO4緩沖液：在pH 6.0的PBS緩沖液中加入MgSO4，使其終濃度為30 mmol/L。

1.2 重組質粒pET28a(+)-AFO-clMagR的構建

根據GenBank中發布的clMagR與AFO基因序列，設計特異性擴增引物。AFO特異性擴增上游引物AFO-F:5′-TGTGAATTCATGGCCACCACAACTGTCCACCGG-3′，AFO下游引物ANCR:5′-TGCGCTAGATGCCATGTGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCCAATCGTCTCTCAAT-3′。

磁蛋白特異性擴增上游引物ANCF:5′-CACATGGCATCTAGCGCATCATCT-3′，磁蛋白下游引物ACR:5-′CCGCTCGAGGATGTTAAAGCTTTCTCC-3′。下劃線所標堿基為限制性內切酶切位點，其中AFO特異性引物上游酶切位點為EcoRⅠ,clMagR下游反向引物酶切位點為XhoⅠ。

以AFO基因為模板，以AFO-F和ANCR為引物，PCR擴增AFO片段；以clMagR基因為模板，以ANCF和ACR為引物，PCR擴增clMagR基因片段。將AFO和clMagR片段回收后，通過融合PCR將兩片段融合和擴增。

使用EcoRⅠ和XhoⅠ將clMagR-AFO基因與pET28a(+)載體分別雙酶切，回收酶切產物后進行連接反應，將構建好的重組質粒命名為clMagR-AFO-pET28a(+)。隨后轉入大腸桿菌DH5α，以挑取的單菌落為模板，使用T7通用引物，進行PCR驗證和測序，提取測序正確的重組質粒轉入大腸桿菌Rosseta(DE3)中，得到clMagR-AFO重組工程菌。質粒提取、膠回收步驟參考試劑盒說明書，酶切、連接、轉化等具體步驟參照文獻[13-14]進行操作。

1.3 重組蛋白的表達與優化

挑取重組轉化子，接入含卡那霉素抗性(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜；以2%接種量將種子培養液在LB液體培養基中擴大培養至OD600為0.6～0.8，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L,16 ℃誘導培養，自第8小時開始，每小時取樣10 mL，直至第19小時誘導結束。參照文獻[13]的步驟，離心、破碎、取上清液，同時將沉淀以一定體積PBS緩沖液溶解，采用SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達水平。

1.4 重組蛋白的分離純化

磁珠對蛋白的富集步驟參照文獻[9]的方法，并在此基礎上進行改進。取500 μL融合表達clMagR-AFO重組菌的破碎細胞上清液到1.5 mL小離心管中，加入100 μL磁珠同蛋白混合，4 ℃緩慢振蕩混合10 min，反應結束后在體系外加磁鐵吸附磁珠-蛋白復合物，棄上清液后移開體系外磁鐵，以1 mL PBS溶液清洗管內混合物，外加磁鐵后棄去未吸附蛋白及其他雜質，重復3次，最終用50 μL EGTA-PBS緩沖液將蛋白溶解，以BCA法測蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳驗證分離效果。

1.5 重組蛋白去毒率測定

實驗組a。在1 mL反應體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即為待測樣品。

實驗組b。將實驗組a中clMagR-AFO-磁珠混合液替換為等量野生型AFO蛋白，其他操作同實驗組a。

對照組a。將982 μL clMagR-AFO蛋白100 ℃、15 min水浴滅活，其他操作與實驗組一致。

對照組b。8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)加入982 μL PBS 緩沖液，過0.22 μm微孔濾膜。

對照組c。8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)加入982 μL PBS緩沖液，100 ℃水浴15 min，過0.22 μm微孔濾膜。

固定化AFO利用率實驗。在1 mL反應體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后，通過外加磁鐵吸附體系內磁珠-clMagR-AFO蛋白復合物，吸取全部上清液，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC檢測；繼續向體內加入AFB1、緩沖液，移去外部磁鐵，使體系內磁珠-clMagR-AFO蛋白復合物同新加入的AFB1進行反應，重復前述步驟。

黃曲霉毒素氧化酶的去毒率通過高效液相色譜法進行檢測[15]。色譜柱為C18柱，流動相由兩相組成，A相為超純水、B相為等體積混合的乙腈-甲醇混合溶液。采用A相(65%)-B相(35%)的等梯度洗脫，流速為1 mL/min，上樣量10 μL，設定熒光檢測器激發波長為365 nm，發射波長為436 nm。

2 結果與討論

2.1 重組菌株的構建

根據NCBI提供的序列，計算得出黃曲霉毒素氧化酶基因AFO與家鴿磁蛋白clMagR基因融合后的全長為2 505 bp。將基因AFO與clMagR進行融合PCR驗證，結果見圖1。由圖1可知，處于2 000～3 000 bp的單一片段(條帶 1)，與clMagR-AFO融合基因理論大小一致。隨后將擴增得到的clMagR-AFO基因片段與pET-28a(+)載體連接，并轉化至大腸桿菌DH5α，使用T7通用引物進行菌落PCR擴增，得到2 500 bp左右的DNA片段(條帶 2)，初步表明AFO與clMagR融合基因已成功連接至pET-28a(+)載體。進一步測序結果表明，clMagR基因位于AFO基因的3′端，序列與預期一致。將測序正確的質粒clMagR-AFO-pET28a(+)轉化入BL21(DE3)，經測序，clMagR-AFO重組表達菌株構建成功。

M—標準DNA; 1—clMagR-AFO融合PCR；2—clMagR-AFO連接pET-28a(+)載體驗證PCR圖1 重組質粒clMagR-AFO- pET-28a(+)的PCR驗證Fig.1 Identification of recombinant plasmid clMagR-AFO-pET-28a(+) by PCR

2.2 融合蛋白的表達及優化

大腸桿菌表達外源基因時，由于其pH、氧化還原電位、滲透壓、折疊機制及輔因子等細胞內環境與基因的原始來源不同，可能會得不到理想的異源蛋白[16-17]，因此需要對蛋白表達條件進行優化。一方面，較高的溫度有利于細胞的生長，但也會增加質粒丟失的風險[18]并加劇異源蛋白包涵體的形成；適當降低誘導溫度，可減慢重組蛋白的合成速率，有助于減少包涵體的形成[19]。另一方面，使用高濃度的誘導劑不僅會加劇誘導蛋白的生產成本，而且存在細胞毒性[20]；適當降低誘導劑濃度，可以有效緩解上述問題[21]。因此，以16 ℃、0.1 mmol/L IPTG進行野生型AFO和clMag-AFO的誘導表達。自誘導8 h起每小時取樣，收集菌體并進行超聲破碎，離心后上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，誘導19 h后結束取樣并檢測蛋白表達量，結果如圖2所示。

由圖2可知：野生型AFO(～7.5×104)在E.coliBL21(DE3)中僅有微量表達(圖2(a)～(d)中的條帶2、6、10)；而添加clMagR蛋白標簽后(～9.0×104)，融合蛋白的表達量有所增加(圖2(d)中的條帶4、8、12)；自誘導第15 小時開始，clMagR-AFO表達量呈上升趨勢(圖2(c)中的條帶4、8、12，圖2(d)中的條帶4、8、12)。綜上，在16 ℃、添加0.1 mmol/L IPTG、誘導19 h條件下，clMag-AFO融合蛋白可溶表達量較高，經測定，融合蛋白表達量為0.092 mg/mL。

2.3 磁珠純化效率分析

將誘導表達后獲得的clMag-AFO融合蛋白進行分離純化?；诖诺鞍拙哂忻黠@內稟磁矩的特性，可被磁性納米顆粒物理吸附至表面從而與其他成分分離[22]，因此本研究通過clMagR與磁性納米鐵珠Fe3O4的物理吸附，將clMag-AFO融合蛋白與細胞內其他雜質蛋白進行分離，分離過程如圖3所示。

M—標準蛋白質。圖2(a)：1、5、9—AFO誘導第8、9、10小時的沉淀；2、6、10—AFO誘導第8、9、10小時的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導第8、9、10小時的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導第8、9、10小時的上清。圖2(b)：1、5、9—AFO誘導第11、12、13小時的沉淀；2、6、10—AFO誘導第11、12、13小時的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導第11、12、13小時的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導第11、12、13小時的上清液。圖2(c)：1、5、9—AFO誘導第14、15、16小時的沉淀；2、6、10—AFO誘導第14、15、16小時的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導第14、15、16小時的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導第14、15、16小時上清液，圖2(d)：1、5、9—AFO誘導第17、18、19小時的沉淀；2、6、10:AFO誘導第17、18、19小時的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導第17、18、19小時的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導第17、18、19小時的上清液圖2 SDS-PAGE電泳驗證clMagR-AFO融合蛋白誘導表達優化Fig.2 SDS-PAGE analysis of clMagR-AFO fusion protein

圖3 磁珠分離裝置及磁珠分離AFO-clMagR蛋白復合體流程Fig.3 Magnetic bead separation device and flow chart of AFO-clMagR protein complex separated by magnetic beads

由圖3可知：破碎重組大腸桿菌菌體并離心后，所得蛋白溶液清澈透亮(圖3(a))；加入磁性納米顆粒后，溶液體系迅速渾濁(圖3(b))，輕搖振蕩使磁珠均勻分布(圖3(c))；外加磁場作用于磁珠-蛋白混合液后，磁珠被迅速吸附至一側，混合溶液恢復至澄清透明(圖3(d))。

為了進一步驗證目的蛋白AFO是否與磁蛋白clMagR一起被納米鐵珠吸附從而與其他細胞內雜蛋白分離，本研究將純化前后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如圖4所示。

M—標準蛋白;1—AFO-clMagR沉淀；2—AFO-clMagR上清液；3—未被磁珠吸附上清液；4—磁珠吸附蛋白圖4 磁珠吸附AFO-clMagR蛋白復合物的SDS-PAGE分析結果Fig.4 SDS-PAGE analysis of magnetic beads adsorbing AFO-clMagR protein complex

由圖4可知，條帶4磁珠吸附蛋白泳道顯示出單一特異性目的條帶，且大小與clMagR-AFO融合蛋白一致，表明clMagR-AFO融合蛋白實現了分離純化。經計算，融合表達細胞破碎液上清液中的目標蛋白質量濃度為0.092 mg/mL，磁珠分離出的目標蛋白質量濃度為0.04 mg/mL。實驗測得磁珠吸附目標蛋白效率約為40 mg/g(以1 g磁蛋計)，與Jiang等[9]測得吸附率3.26 mg/g相比，本研究的吸附效率明顯提高。產生該結果的原因一方面是由于本研究中AFO蛋白分子量為7.5×104，而Jiang等所用蛋白分子量為2.5×104，在吸附相同摩爾數蛋白的情況下，本研究中的吸附蛋白質量比Jiang等實驗中提供的數據高是正?，F象；另一方面，可能是由于本研究中AFO的折疊結構使得融合蛋白之間以clMagR為中心發生聚合，不僅clMagR組裝成了較為規則的聚合體結構，而且AFO蛋白分子之間通過氫鍵、離子鍵及范德華力等相互作用，使得組裝構型更加穩定，組裝后的整體分子量大大增加且具永久磁矩，在外加磁場的作用下有更佳的磁感應性。由此可見，當clMagR作為蛋白純化標簽時，可拖動7.5×104左右的蛋白吸附在磁珠表面，并能增加AFO蛋白的可溶表達。

2.4 融合蛋白去毒率分析

通過液相色譜測定不同濃度黃曲霉毒素AFB1的吸收峰面積，作圖獲得黃曲霉毒素AFB1的計算公式為y=11 527x-45 865,R2=0.999 9。其中，y為峰面積，x為AFB1質量濃度(ng/mL)，R2為標準相關系數。

在1 mL反應體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即為待測樣品。

為測定clMagR磁蛋白標簽對于AFO降解黃曲霉毒素能力的影響，分別將clMagR-AFO-磁珠混合液、等摩爾量AFO蛋白(未融合clMagR蛋白)加入50 μg/mL AFB1溶液中，反應30 min后滅活AFO蛋白，并通過液相色譜測定剩余AFB1的量，結果如圖5所示。

由圖5可知：AFB1標準品的出峰時間約為10 min，反應前檢測得到體系內AFB1峰面積(色譜峰a)，換算成質量濃度為400 ng/mL；在加入clMagR-AFO蛋白、pH 6.0、30 ℃、30 min的條件下催化反應，體系內的AFB1質量濃度降至96.26 ng/mL(色譜峰b)；在加入AFO蛋白、同等條件下反應后，AFB1質量濃度降至80.96 ng/mL(色譜峰c)。因此，clMagR-AFO的AFB1去毒率為75.94%，未融合clMagR的AFO的AFB1去毒率為79.76%。該結果表明，磁蛋白clMagR純化標簽對黃曲霉毒素氧化酶AFO水解AFB1的酶活無顯著影響。

a—滅活蛋白對照組；b—clMagR-AFO與AFB1反應色譜峰；c—AFO與AFB1反應色譜峰；d—PBS溶液圖5 HPLC檢測AFO去毒率Fig.5 Detoxification rate for AFO by HPLC

為驗證100 ℃水浴對AFB1檢測的影響，采用液相色譜法測定沸水浴前后溶液中AFB1的變化，結果如圖6所示。

由圖6可知，AFB1沸水浴前的樣品峰(色譜峰a)與AFB1沸水浴后的樣品峰(色譜峰b)完全重合，根據AFB1濃度計算公式，計算出兩體系中的樣品質量濃度皆為400 ng/mL，說明15 min的沸水浴對AFB1無影響。

圖6 沸水浴15 min對AFB1檢測影響Fig.6 Effects of AFB1 on the boiling water bath after 15 min by HPLC

將吸附于納米磁珠表面的clMagR-AFO視為固定化酶，為提高酶的利用率，考察固定化酶的重復使用次數。在每一批反應結束后，通過外加磁鐵吸附體系內磁珠-clMagR-AFO蛋白復合物，待吸取全部上清液后，繼續向體內加入AFB1，并移去外部磁鐵，使體系內磁珠-clMagR-AFO蛋白復合物同新加入的AFB1進行反應(數據未顯示)。結果發現：固定化AFO重復使用至第5次時，AFO對AFB1去毒率仍保持初始去毒率的50%以上；繼續重復使用時，固定化AFO的酶活下降明顯，當重復至第10批反應時，其降解黃曲霉素的能力僅為初始去毒率的7.55%。綜上所述，經磁性納米鐵珠固定化的融合蛋白clMagR-AFO可作為固定化酶進行重復使用，且在前5批反應中表現出良好的去毒率。

3 結論

將家鴿磁蛋白clMagR與7.5×104的黃曲霉毒素氧化酶AFO共表達，基于磁蛋白的外部磁場響應性，使用納米磁珠實現了黃曲霉毒素氧化酶的分離純化，同時驗證了磁蛋白標簽純化大分子量蛋白的效果。進一步的去毒率實驗結果表明，純化后的AFO蛋白保持了75.94%的AFB1去毒率，與野生型AFO的AFB1去毒率79.76%相比，clMagR純化標簽對AFO的酶活無顯著影響。此外，磁珠固定化的AFO可作為固定化酶重復利用5次仍保持較好的去毒率。本研究建立了新型的基于磁蛋白標簽的AFB1清除體系，為AFB1的去毒化研究提供了新的方向，也為蛋白純化與固定化研究提供了有益借鑒。