N-乙酰半胱氨酸對軟骨細胞基質降解和骨關節炎的作用研究

張衛華，張建業，葉恒，李永壽

(1.武漢市漢陽醫院骨科，湖北 武漢 430050；2.湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以關節軟骨變性、骨質疏松及滑膜炎為特征的慢性骨關節疾病，中老年人較為常見，臨床主要表現為關節疼痛、活動受限等，甚至可導致殘疾，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。OA病理特征主要以軟骨基質的降解和破壞為主，其與衰老、氧化應激、炎癥反應和分解代謝相關的基因表達有關[3-4]。目前，臨床骨關節炎并無特效治療，因此，尋找用于治療骨關節炎的藥物是一項重要目標。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種谷胱甘肽前體，可以通過靶向于活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生抗氧化作用，并且對許多ROS相關的疾病動物模型均有良好的抗氧化作用[5-6]。但是，NAC對于治療骨關節炎的作用及其相關機制研究較少，因此，本研究通過建立體內外模型探討了NAC的抗骨關節炎作用及其相關的分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(ST316)，碘化吡啶(propidium iodide，PI)染色液(P0137)，ROS檢測試劑盒(S0033)，蛋白裂解液(P0013C)，蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(P1046)，超氧化物(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(S0060)，總谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)檢測試劑盒(S0058)購自碧云天生物科技有限公司(中國)；Anti-基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotinase，MMP)-3(#14351)，Anti-MMP-9(#13667)，Anti-MMP-13(#69926)，Anti-GAPDH(#5174)購自Cell Signaling生物公司(美國)；Anti-ADAMTS 4(PA1-1749A)購自賽默飛生物科技有限公司(美國)。

1.2 細胞培養 人軟骨細胞(HC-A)購自Sigma公司(美國)，用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養基，于5% CO2和37℃的細胞培養箱(賽默飛，美國)中培養。

1.3 MTT試驗 以1×106個/mL密度將HC-A細胞接種于96孔板，過夜培養，待細胞長至80%時，將細胞分為對照組、白細胞介素(interleukin，IL)-β及IL-β+NAC(2.5、5、10 mmol/L)組，用不同濃度的NAC預處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，根據制造商說明書使用MTT液檢測細胞活力。

1.4 PI染色 以1×106個/mL密度將HC-A細胞接種于24孔板(預先放入細胞爬片)，過夜培養，將細胞分為對照組和NAC(10 mmol/L)組，NAC組加入10 mmol/L NAC，對照組加入無血清DMEM/F12培養液，于37℃培養24 h，隨后棄掉培養基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌1次，加入PI和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液進行染色30 min，棄掉染液，用PBS洗滌3次，5 min/次，然后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，用PBS洗滌3次，5 min/次，最后使用共聚焦熒光顯微鏡觀察拍照檢測。

1.5 細胞內ROS檢測 以1×106個/mL密度將HC-A細胞接種于96孔板，過夜培養，待細胞長至80%時將細胞分為對照組、IL-β及IL-β+NAC(2.5、5、10 mmol/L)組，用不同濃度的NAC預處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，棄掉培養基，加入2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2'，7'-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針于37℃反應20 min，使用酶標儀于波長488/525 nm檢測熒光值。

1.6 SOD和GPX活性檢測 細胞處理結束后，根據制造商要求使用商業試劑盒檢測細胞內的SOD和GPX活性。

1.7 蛋白免疫印跡 buffer(4×)于100℃煮沸5 min，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分離蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏佛乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用一抗(MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS 4及GAPDH，按1︰1 000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗[辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗兔IG和HRP標記山羊抗鼠IG，按1︰10 000稀釋]室溫孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學發光法顯影檢測，Image J分析灰度值。

1.8 軟骨細胞基質的形態學檢測 以1×106個/mL密度將HC-A細胞接種于24孔板(預先放入細胞爬片)，過夜培養，將細胞分為對照組、IL-1β組和IL-1β+NAC組，先用NAC預處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，棄掉培養基，細胞在95%乙醇中固定，然后在室溫下用1%阿爾新藍染料(pH 1.0)染色過夜，隨后使用倒置顯微鏡觀察拍照。

1.9 OA動物模型 采用右膝關節前交叉韌帶切斷術建立OA大鼠模型，在第0天造模，提前禁食12 h，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于實驗操作臺，右膝關節刮毛備皮后用碘伏消毒。在無菌情況下，于膝關節內側切約1 cm縱向切口，打開關節腔，同時切斷前交叉韌帶、內側副韌帶和內側半月板，縫合傷口。術后連續肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)，假手術組在沒有其他任何處理的情況下，縫合傷口，以手術當天為第0天。

1.10 給藥與分組 SPF級別SD雄性大鼠48只(220～250 g)購于湖北醫藥學院基礎醫學院，隨機分為假手術組、模型組、NAC-12.5 mg/kg、NAC-25 mg/kg、NAC-50 mg/kg及陽性對照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，n=8。手術后2周(即第14天)開始灌胃給藥，每天1次，模型組和假手術組灌胃給予等體積的CMCNa(0.5%)，連續給藥3周，在第35天行為學檢測結束后腹主動脈取血，脫頸椎處死，分離大鼠關節軟骨組織。

1.11 機械性痛閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWT)檢測 采用電子自動爪觸覺測試儀測定實驗大鼠的機械刺激縮爪閾值PWT(單位：g)，每周測量1次，將刺激針對準足底并逐漸增加刺激力量，大鼠感覺到痛覺后移開刺激針，設備記錄并顯示足瞬間移開的最大值，即PWT，隔5 min測量1次，連續測量3次，取其平均值。

1.12 反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 分離和收集實驗大鼠的膝關節軟骨組織，稱取約30mg，加入1 mL Trizol裂解液，組織研磨儀勻漿，提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer檢測RNA的濃度和純度，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser(寶日醫生物技術有限公司，日本)將RNA(1 μg)逆轉錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(諾唯贊，中國)的CFX ConnectTMReal-Time系統(BioRad，美國)進行qRT-PCR定量分析。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，重復40個循環，最后根據2-ΔΔCt法計算MMP-3、MMP-9、MMP-13、GAPDH mRNA的表達水平，引物序列：MMP-3 Forward：5’-AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT-3’，MMP-3 Reverse：5’-TCCCCGTCACCTCCAATCC-3’；MMP-9 Forward：5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’，MMP-9 Reverse：5’-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3’；MMP-13 Forward：5’-ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG-3’；MMP-13 Reverse：5’-GAACCCCGCATCTTGGCTT-3’；GAPDH Forward：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，GAPDH Reverse：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.13 組織病理學 采用番紅固綠染色檢測大鼠軟骨組織病理變化，分離收集實驗大鼠的膝關節軟骨組織，置于10%福爾馬林固定24 h，然后用EDTA脫鈣液(0.5 M，pH=8)脫鈣15 d，隔3 d換1次液，石蠟包埋，切成4 μm薄片，番紅固綠染色并觀察軟骨病理變化。

2 實驗結果

2.1 NAC對軟骨細胞細胞活力的影響 首先采用MTT法檢測了IL-1β和NAC對軟骨細胞HC-A細胞活性的影響，表明IL-1β(1 ng/mL)或IL-1β(1 ng/mL)+NAC(2.5、5、10 mmol/L)與對照組相比，對軟骨細胞的細胞活力均無影響(P>0.05，見圖1a)，同時PI染色結果表明NAC(10 mmol/L)也不能夠引起細胞凋亡(見圖1b)，因此，2.5、5、10 mmol/L的NAC及L-1β(1 ng/mL)應用于后續實驗研究。

2.2 NAC對IL-1β誘導氧化應激的影響 大量ROS產生在軟骨基質炎癥病理變化過程中起著至關重要的作用，本研究結果表明IL-1β能夠引起軟骨細胞產生大量的ROS，預先給予NAC呈劑量依賴性降低ROS含量(P<0.05，見圖2a)。同時，NAC預處理也能夠抑制IL-1β誘導的軟骨細胞GPX和SOD活性(P<0.05，見圖2b和2c)，這表明在軟骨細胞中NAC能夠抑制IL-1β誘導的氧化應激。

2.3 NAC對IL-1β誘導軟骨細胞MMP表達及基質降解的影響 采用蛋白印跡法檢測了NAC對IL-1β誘導的軟骨細胞MMP表達的影響，結果表明IL-1β顯著上調軟骨細胞MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4的蛋白表達水平，NAC預處理顯著下調IL-1β誘導的MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4蛋白上調(P<0.05，見圖3a)，同時，NAC也能夠抑制IL-1β引起的軟骨細胞基質降解(見圖3b)。

2.4 NAC對骨關節炎大鼠PWT和膝關節直徑的影響 結果表明模型組大鼠的PWT值較假手術組顯著減小，灌胃給予NAC呈劑量性顯著增加OA大鼠的PWT值(P<0.05，見圖4a)；同時，膝關節直徑結果表明模型組大鼠的膝關節直徑顯著增加，但灌胃給予NAC呈劑量依賴性顯著減小OA大鼠的膝關節直徑(P<0.05，見圖4b)，這表明本研究成功建立了OA大鼠模型，同時表明NAC對OA具有潛在的保護作用。

2.5 NAC對骨關節炎大鼠軟骨組織MMP表達及基質降解的影響 RT-PCR結果表明模型組大鼠軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達水平顯著上調，但給予NAC呈劑量依賴性下調OA大鼠軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達水平(P<0.05，見圖5a～c)。同時，番紅固綠染色結果表明模型組大鼠的軟骨基質出現降解和破壞，給予NAC能夠顯著緩解OA大鼠的軟骨基質破壞和降解(見圖5d)。

a 軟骨細胞的MTT細胞活性檢測結果 b 軟骨細胞的PI染色結果(×40；紅色：PI，藍色：DAPI)

a 軟骨細胞中ROS的含量 b 軟骨細胞中GPX的活性 c 軟骨細胞中SOD的活性

a 軟骨細胞MMP的蛋白表達水平

b 軟骨細胞基質染色結果(×40，阿爾法新藍)

a OA大鼠的PWT值 b OA大鼠的膝關節直徑

a OA大鼠軟骨組織中MMP-3的表達水平 b OA大鼠軟骨組織中MMP-9的表達水平 c OA大鼠軟骨組織中MMP-13的表達水平

d OA大鼠軟骨組織染色結果(番紅固綠染色)

3 討 論

關節軟骨組織主要由軟骨細胞和軟骨細胞外基質(extracellular matrix，ECM)組成，在正常生理條件下，其處于一種穩態水平，供氧量極少[7-8]。然而，機體發生異常時能夠產生許多有害因子，其能夠激活機體氧化應激，引起ROS的過量產生[9]。大量ROS能夠通過影響細胞內信號通路包括細胞因子受體、受體酪氨酸激酶及G蛋白耦聯受體等引起ECM降解。除此之外，ROS也能夠通過激活有絲分裂原激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路[10]。最終，細胞內信號轉導通路通過介導膠原酶活化的MMP引起ECM降解[11]。

IL-1作為第一個被鑒定的IL，其能夠影響所用的細胞及器官，且是自身炎癥、免疫及傳染性和退行性疾病的主要影響因子[12]。IL-1β作為IL-1的亞型之一，是一種重要的促炎細胞因子，其能夠通過Ⅰ型IL-1受體(IL-1R1)發揮效應，在OA的病理發展過程中起著至關重要的作用，研究表明IL-1R1受體拮抗劑可用于關節炎的治療[13]。IL-1β信號通路能夠通過加速ECM降解并誘導過量ROS產生以及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的表達，進而促進OA的病理發展[14]。因此，本研究首先采用IL-1β誘導的軟骨細胞模型探討了NAC對軟骨基質降解的作用及相關分子機制，本研究表明在軟骨細胞中NAC能夠抑制IL-1β引起的ROS產生、GPX及SOD活性，上述表明NAC能抑制細胞發生的氧化應激反應。研究表明ROS對于降解ECM相關的MMPs是至關重要的，ROS能夠通過細胞內一系列信號轉導通路引起MMP的表達，進而引起膠原酶的活化，導致ECM降解[11]。本研究表明在軟骨細胞中NAC能夠下調IL-1β誘導的MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4的表達，同時抑制IL-1β誘導的ECM降解。上述表明NAC可能通過清除細胞內ROS抑制MMP的表達，進而產生抗ECM降解作用。

氧化應激引起的ECM降解在OA的病理發展過程中起著重要的作用，由于體外結果表明NAC能夠通過抑制細胞氧化應激緩解ECM降解，這暗示著NAC具有潛在治療骨關節炎作用[15]，因此，接下來本研究采用骨關節炎大鼠模型評價了NAC的抗骨關節炎作用及其對ECM降解的影響。首先，根據之前的研究采用膝關節交叉韌帶切斷術建立骨關節炎大鼠模型用于后續的藥物干預研究[16]。結果表明模型組大鼠的膝關節腫脹顯著增大，同時PWT小于假手術組，這表明本研究成功建立了OA大鼠模型，為后面的實驗干預研究提供了實驗基礎。同時，研究表明NAC呈劑量和時間依賴性增加OA大鼠的PWT，減小膝關節直徑，上述說明NAC能夠緩解OA大鼠的關節腫脹和疼痛，對OA具有一定的潛在療效。同時，體內結果表明灌胃給予NAC能夠顯著下調軟骨組織中MMP-3、MMP-9及MMP-13的表達，上述表明NAC對OA具有潛在的治療效果，并且與可能與抑制MMPs表達有關。

總的來說，本研究結果表明NAC對OA具有潛在的治療作用，且這種作用與抑制MMP介導的ECM降解有關。但是，NAC是否能夠通過影響其他的信號轉導通路產生抗骨關節炎效應依然是未知的，因此，仍需進一步探索。