尼克酰胺-N-甲基轉移酶在肺腺癌間質中的表達及其生物學功能

鞠薇薇，于生金，林黎娟，邵志翔，張奇芳，江黎黎△

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居高不下［1］。尋找肺癌早期標志物以及預后指標將有助于早期診斷，并為治療提供新思路。尼克酰胺-N- 甲基轉移酶（nicotinamide Nmethyltransferase，NNMT）是人體內重要的甲基化酶，可以催化尼克酰胺和其他吡啶衍生物的甲基化，并參與多種化合物的生物轉化［2］。正常人體內NNMT 主要在肝臟內表達，但越來越多的研究發現NNMT 在皮膚腫瘤［3］、膠質瘤［4］、胰腺癌［5］、胃癌［6］和腸癌［7］等多種腫瘤組織中異常表達。上述研究僅關注了NNMT在腫瘤細胞中的表達和功能。最近有文獻報道了卵巢癌間質腫瘤相關成纖維細胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）中的NNMT 可以顯著促進卵巢癌的惡性進展［8］。NNMT 在其他腫瘤間質中是否也有表達及相似功能尚不明了。本研究通過體內和體外實驗探討肺腺癌間質細胞中NNMT的表達與腫瘤惡性進展及患者預后的關系，以期為深入研究NNMT在肺腺癌中的作用提供實驗基礎和思路。

1 資料與方法

1.1 標本來源 搜集丹東市第一醫院2010年1月—2013年12 月收治的150 例肺腺癌患者手術切除的組織標本。納入標準：（1）患者術前均未經放化療及其他治療。（2）手術后組織病理結果為肺腺癌?；颊吣挲g38～86歲，中位年齡60歲；男89 例，女61 例；TNM 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期105 例，Ⅲ～Ⅳ期45例。本研究得到本院倫理委員會批準，并且所有患者均簽署知情同意書。對納入患者采用電話、查閱病歷和寫信等方式進行隨訪，隨訪截止時間為2019 年6 月，隨訪時間4～96 個月，中位隨訪時間77個月，隨訪信息完整者共101例。

1.2 細胞及試劑 人肺成纖維細胞HLF-1及肺腺癌細胞系A549 和PC9 購自美國模式菌種收集中心（ATCC），兔抗人NNMT多克隆抗體（ab223513）、內參β-actin抗體（ab8226）購自英國Abcam 公司，免疫組化專用一抗稀釋液、辣根過氧化物酶標記通用二抗（PV-6000）及DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞培養所用胎牛血清和培養液購自美國Gibco 公司。過表達NNMT 質粒、對照質粒及慢病毒載體委托上海吉凱基因公司合成并包被。TRIzol試劑購自美國Invitrogen 公司，SYBR Green PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司。Alexa fluo594（A-11012）購自美國Thermo公司；CCK-8 試劑盒、RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色檢測腺癌組織中NNMT 表達 染色采用SP二步法，組織切片常規脫蠟水化，高壓修復暴露抗原，雙氧水孵育去除內源性過氧化物酶，兔抗人NNMT 一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，免疫組化通用二抗室溫孵育1 h，DAB 顯色2 min。免疫組化結果判斷：綜合考慮陽性細胞數和陽性強度，采用半定量方法，依據陽性細胞比例［0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%）及4 分（76%～100%）］和著色強度［0分（無著色），1分（淡黃色），2分（棕黃色）及3分（棕褐色）］，將2個分值相乘，每張切片于熱點區域隨機讀取10個高倍視野，對腫瘤細胞和腫瘤間質分別進行評分。最后按評分結果將所有病例標本劃分為2組，0～4分為低表達組，5～12分為高表達組。

1.4 穩定表達NNMT 細胞系的構建及鑒定 人肺成纖維細胞HLF-1 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基培養于37 ℃、5%CO2培養箱中。實驗設過表達NNMT 質粒（NNMT組）和對照質粒（control組）。提前24 h將HLF-1細胞接種至6孔板，按照感染復數計算所需病毒量，然后將NNMT過表達質粒及對照質粒分別感染對數生長期的HLF細胞；48 h后用1 mg/L 嘌呤霉素篩選細胞，最終獲得穩定表達NNMT 的HLF-1細胞。

1.4.1 熒光定量PCR（qPCR）檢測HLF-1 中NNMT 的mRNA表達 取穩定轉染后的過表達NNMT 組和control 組HLF-1細胞，TRIzol 法提取RNA 并用凝膠電泳對其質量進行評估。使用Power SYBR Green 進行qPCR，以GAPDH 為內參。NNMT 上游引物5'-AGGAACCAGGAGCCTTTGACT-3'，下游引物5'-CCTGAGGGCAGTGCGATAGG-3'；GAPDH 上游引物5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' ，下 游 引 物 5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。按照PCR 檢測試劑盒說明書進行實驗，擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環。結果采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4.2 細胞免疫熒光染色檢測HLF-1 細胞中NNMT 蛋白表達水平 將2組細胞接種至細胞爬片，24 h后取出細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.2%Triton X-100室溫破膜10 min，封閉液室溫封閉1 h，一抗（1∶100 稀釋）4 ℃過夜，二抗Alexa fluo594（1∶200）室溫下反應1 h，DAPI核染色，封片。在激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.4.3 Western blot 檢測HLF-1 細胞中NNMT 蛋白表達水平 取對數生長期的2 組細胞（約2×106個），RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法測量蛋白濃度后上樣（50 μg），10% SDSPAGE 90 min，250 mA轉膜2 h濕轉法將蛋白轉移于PVDF膜上，切取含目的條帶的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。NNMT（1∶2 000）與β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃孵育過夜，次日羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 細胞共培養 NNMT組及control組HLF-1細胞常規培養24 h后收集培養液至50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸取上清作為培養基加入A549和PC9細胞中進行共培養。

1.5.1 CCK-8法檢測細胞增殖能力 取共培養后的A549和PC9 細胞，接種于96 孔板中（2.5×104/mL），各組設3 個復孔，然后分別在培養24、48、72、96及120 h棄去原有培養液，加入含10%CCK-8 的培養液100 μL，孵育2 h 后用酶標儀測各孔490 nm處的光密度（OD）值，并繪制生長曲線。

1.5.2 平板克隆形成實驗 取共培養后的A549 和PC9 細胞，1 000 個/孔接種于6 孔板中，靜置培養10～14 d，當出現肉眼可見的克隆時，棄去上清液，加入甲醇于-20 ℃冰箱中固定克隆6 min，0.1%結晶紫溶液室溫染色30 min。在光學顯微鏡（400倍）下計數＞50個細胞的克隆數。

1.5.3 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 取對數生長期A549和PC9細胞，制備單細胞懸液，離心后用不含血清的培養液重懸細胞計數，在小室的上室中加入約10 000 個細胞，在24孔板中加入500 μL穩定表達NNMT的肺成纖維細胞系及control 組細胞24 h的培養液，將小室放在24孔板中；培養24 h 后，棉簽擦拭上室中未穿過小室膜的細胞，結晶紫染色后在顯微鏡下采集圖像，40 倍光學顯微鏡下隨機讀取10 個視野，記錄穿膜細胞數并進行統計分析。

1.5.4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期A549 和PC9 細胞，5×105個/孔接種于6 孔板中。24 h 后用20 μL移液器槍頭在細胞表面劃痕，PBS清洗脫落細胞，加入穩定表達NNMT 的肺成纖維細胞系及control 組細胞24 h 的培養液，于24 h 在光學顯微鏡下測量劃痕寬度并拍照，計算細胞遷移率，遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制不同NNMT 表達情況肺腺癌患者的生存曲線，Log-rank 檢驗比較生存率的差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 NNMT expression in lung adenocarcinoma(DAB staining,×400)圖1 NNMT在肺腺癌組織中的表達（DAB顯色，×400）

Fig.2 The survival curves of patients with high and low NNMT expressions in lung adenocarcinoma圖2 肺腺癌中NNMT高表達和低表達患者的生存曲線

2.1 NNMT在肺癌組織中的表達及其與患者預后及臨床病理特征關系 免疫組化染色結果顯示，NNMT 在肺腺癌癌細胞和間質細胞中均有表達，且主要定位在細胞質，見圖1。經半定量分析后，150例患者中65例癌細胞中NNMT高表達，83例間質細胞中NNMT高表達。生存分析結果見圖2，癌細胞中高表達與低表達NNMT患者的總生存率差異無統計學意義（Log-rankχ2=2.625，P＞0.05），而腫瘤間質細胞中高表達NNMT患者的總生存率明顯低于低表達者（Log-rankχ2=9.685，P＜0.01），預后較差。有淋巴結轉移和病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤間質細胞中NNMT高表達比例較高；同時病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤細胞中NNMT 高表達比例較高，其他不同臨床病理特征間差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of NNMT in tumor stromal cells and tumor cells of lung adenocarcinoma between patients with different clinicopathological features表1 不同臨床病理特征的肺腺癌患者的腫瘤間質及腫瘤細胞NNMT表達水平比較 例（%）

2.2 成功構建穩定過表達NNMT 的HFL-1 細胞 Western blot（圖3A）、qPCR（圖3B）、細胞免疫熒光染色（圖3C）結果均顯示，NNMT 組NNMT 的表達水平均高于control組。

2.3 肺成纖維細胞中過表達NNMT 對肺癌細胞遷移的影響 劃痕愈合實驗和Transwell 實驗結果顯示，與control組相比，NNMT組的HFL-1的培養液均可促進A549 和PC9 細胞的遷移和侵襲。見表2、圖4。

Fig.3 Identification of stable NNMT expression in HFL-1 cells圖3 HFL-1細胞中穩定表達NNMT的鑒定結果

Tab.2 Comparison of cell mobility and invasion number between control group and NNMT group表2 Control組和NNMT組細胞遷移率和侵襲數量比較（n=3，x±s）

2.4 HFL-1 的培養液對A549 和PC9 增殖及克隆的影響 HFL-1 培養液與肺癌細胞共培養后發現，與control 組相比，NNMT 組A549 和PC9 細胞增殖速度自2 d 起均顯著加快（圖5A），細胞克隆的形成能力明顯提高［A549 細胞：（93.00±13.45）個/視野vs.（56.67±4.16）個/視野，t=4.469，P＜0.01；PC9 細胞：（160.70±11.02）個/視野vs.（91.67±9.67）個/視野，t=7.465，P＜0.01］，見圖5B。

Fig.4 Changes of lung cancer cell migration and invasion ability in control group and NNMT group圖4 對照組和NNMT組肺癌細胞遷移和侵襲能力變化

Fig.5 Changes of proliferation and clone formation of lung cancer cells in control group and NNMT group圖5 對照組和NNMT組肺癌細胞增殖及克隆形成數量變化

3 討論

近年來，肺癌的手術治療、輔助化療以及靶向治療均取得了較大的進展，但肺癌5 年生存率依然很低。因此，尋求新的治療靶點及預后指標能夠為肺癌治療提供新思路。在本研究中，筆者發現肺腺癌間質細胞中高表達NNMT 提示患者不良預后，而且CAF的條件培養基可以促進肺癌細胞的惡性進展。

NNMT 是N-甲基轉移酶家族的一種胞質酶，可以通過消耗甲基供體和產生活性代謝物參與調節脂肪、肝臟等組織代謝；NNMT的活性升高可有效降低細胞內的煙酰胺水平，進而抑制細胞凋亡［9］。研究發現NNMT 在多種癌細胞中呈高表達，而且NNMT的上調參與了多種惡性腫瘤細胞的增殖和遷移，NNMT 可能是一種潛在的腫瘤標志物［10-11］。Tomida等［12］發現肺癌患者血清中NNMT水平顯著高于健康人群，且比常用的血清指標癌胚抗原（CEA）更加敏感。另有研究發現NNMT在肺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，在肺癌細胞中敲減NNMT后，細胞的增殖和克隆形成能力均受到抑制［13］。另外，NNMT在非小細胞肺癌對靶向藥物耐藥過程中也起著重要的作用［14］。然而，關于NNMT 促進肺癌發生發展的確切分子機制仍不清楚。

腫瘤微環境在腫瘤生長和轉移過程中起著重要的作用，CAF 作為腫瘤微環境中最主要的細胞成分之一，可以促進腫瘤的發生發展［15-16］。研究發現，敲減CAF 細胞中的NNMT 后，細胞內與轉錄調控相關的組蛋白的甲基化修飾顯著增加，進而調控多種基因的表達，其中包括多種癌基因［8］。但目前尚不清楚NNMT在肺癌間質中是否發揮著相似的促進腫瘤惡性進展的功能。本研究在人成纖維細胞系HFL-1中過表達NNMT，然后收集過表達NNMT 細胞和control 組細胞的培養液，用以上2 種培養液培養肺腺癌細胞A549 和PC9，比較2 組培養液對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結果發現，來源于過表達NNMT組的培養液可以顯著促進肺癌細胞的增殖和克隆的形成，而且對肺癌細胞的遷移和侵襲能力也有顯著的促進作用，提示CAF 的條件培養基可以促進肺腺癌細胞的惡性轉化。NNMT作為一種活躍的代謝酶，是通過影響間質細胞的代謝進而影響腫瘤細胞，還是通過外泌體等途徑將間質細胞的NNMT 直接轉移到腫瘤細胞中，其中涉及的具體機制尚需進一步的實驗證實。同時本研究免疫組化結果顯示，NNMT 在肺腺癌的癌細胞和間質細胞中均有表達。其中，腫瘤間質中NNMT 的蛋白表達水平與淋巴結轉移、臨床分期有關，而且腫瘤間質中的高表達NNMT 的患者總生存率明顯下降，提示肺癌間質中的NNMT可促進腫瘤細胞的惡性進展。

綜上，肺腺癌間質中的NNMT 在肺癌惡性轉化過程中起著重要的促進作用，有可能成為腫瘤靶向生物治療的潛在靶點。