基于數(shù)據(jù)挖掘分析Elafin在肺癌中的表達(dá)及意義

彭旭紅，蔣靜，屈佳肴，李香凝，王麗，李佳，段麗麗△

肺癌是最常見的癌癥，也是死亡率最高的癌癥，大多數(shù)的肺癌患者被確診時(shí)已經(jīng)處于晚期［1］。盡管當(dāng)前對(duì)于肺癌治療方法的研究有所進(jìn)展，然而肺癌的總體治愈率和生存率仍然較低［2-3］。尋找有效的分子靶標(biāo)對(duì)肺癌的治療和預(yù)后具有重要的臨床意義。彈性蛋白酶抑制因子（Elafin）蛋白是由PI3基因編碼的蛋白質(zhì)。PI3 基因最初編碼由117 個(gè)氨基酸構(gòu)成的Elafin 前體蛋白原，前體蛋白原降解前22 個(gè)氨基酸（信號(hào)肽）形成Elafin 前體蛋白。前體蛋白有N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端可與細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白組分以及上皮細(xì)胞膜相連接，C 端主要抑制彈性蛋白酶［4］。國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于Elafin 在癌癥中作用的報(bào)道，Elafin 可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如Elafin 表達(dá)水平與腫瘤的分化程度相關(guān)，在高分化的食管癌中表達(dá)水平更高［5］。Elafin 可通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號(hào)通路刺激卵巢癌細(xì)胞增殖［6］。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，F(xiàn)OXA2）在表觀遺傳學(xué)調(diào)控下激活Elafin 啟動(dòng)子從而上調(diào)Elafin 表達(dá)，Elafin 高表達(dá)誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡［7］。然而，Elafin在肺癌中的研究報(bào)道尚罕見。近年來(lái)隨著高通量技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多數(shù)據(jù)庫(kù)分析Elafin 在肺癌中的表達(dá)及其潛在作用與機(jī)制成為可能［8］。本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）以及Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)分析Elafin 在肺癌的表達(dá)和預(yù)后關(guān)系，通過(guò)Linkedomics 和string-db數(shù)據(jù)庫(kù)分析了Elafin 影響肺癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制，為后續(xù)研究其潛在的臨床價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析Elafin 在肺癌組織中的表達(dá) Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.oncomine.org/）設(shè)置條件為：（1）“Gene：Elafin”。（2）“Analysis Type：Cancer vs.Normal”。（3）“Cancer Type：Lung Cancer”。（4）“Data Type：mRNA”。探究Elafin在肺癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況。

1.2 Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析肺癌中Elafin表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//kmplot.com/）設(shè)置條件為：（1）“mRNA gene chip：Lung Cancer”。（2）“Gene：Elafin”。（3）“Split patients by：Auto”。（4）“Survival：OS or RFS”。其余設(shè)置為默認(rèn)條件，探究Elafin的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 Linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA LUAD數(shù)據(jù)集中Elafin相關(guān)分析 Linkedomics 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.linkedomics.org/）設(shè)置條 件 為：（1）“Cancer Cohort：TCGA_LUAD”。（2）“ Search Dataset：TCGA LUAD Rnaseq”。（3）“Gene：PI3”。（4）“Target Dataset：TCGA LUAD Rnaseq。（5）“Statistical Method：“Pearson Correlation test”。探究Elafin 在肺TCGA_LUAD 數(shù)據(jù)集中的相關(guān)基因并通過(guò)GSEA tools 進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。

1.4 Elafin蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 string-db數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）與cytoscape 軟件構(gòu)建Elafin相關(guān)蛋白相互作用圖，以網(wǎng)站默認(rèn)設(shè)置為設(shè)置條件，采取中度置信度（0.400）。

1.5 qPCR 法檢測(cè)Elafin 在肺癌組織中的表達(dá) 取2015 年9月—2016年1月郴州市第一人民醫(yī)院住院并確診為肺癌的患者癌組織與配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，其中男8例，女2例，年齡50～70歲，平均（60±3）歲。提取組織RNA，利用美國(guó)Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Elafin、GAPDH引物序列設(shè)計(jì)根據(jù)Pubmed基因序列。引物序列：Elafin上游引物5'-TCTTGATCGTGGTGGTGTTCCTCA-3'，下 游 引 物 5'-TTTGACTGGCTCTTGCGCTTTGAC-3'，產(chǎn)物大小182 bp；GAPDH上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，產(chǎn)物大小121 bp。以GAPDH作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系如下：2×TaqDNA聚合酶mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，DEPC水3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃20 s，56 ℃20 s，72 ℃30 s（熒光采集），共40個(gè)循環(huán)，讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Elafin的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，配對(duì)樣本比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法比較Elafin 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用Logrank檢驗(yàn)比較組間生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elafin mRNA 在肺癌組織中的表達(dá) 在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)的Bhattacharjee Lung 數(shù)據(jù)集以及Wachi Lung數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，肺癌中Elafin的mRNA表達(dá)顯著高于肺正常組織，見圖1。本研究qPCR結(jié)果顯示，肺癌組織中Elafin 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量（3.410±1.056）高于配對(duì)正常組織的（0.820±0.119），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.644，P＜0.05），見圖2。以上結(jié)果提示Elafin在肺癌中過(guò)表達(dá)。

2.2 Elafin 表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Elafin表達(dá)與肺癌患者預(yù)后作生存分析，以Elafin 表達(dá)水平高低對(duì)肺癌患者進(jìn)行分組。生存分析納入1 925 例肺癌患者，Elafin 相對(duì)表達(dá)量的Cut-off值為303，Elafin相對(duì)表達(dá)量≥303為高表達(dá)組（545例），＜303為低表達(dá)組（1 380例）；高表達(dá)組患者的中位生存期低于低表達(dá)組（47個(gè)月vs.78 個(gè)月，P＜0.01）。無(wú)病生存分析納入344 例肺癌患者，Elafin 相對(duì)表達(dá)量的Cut-off 值為33，Elafin 相對(duì)表達(dá)量≥33為高表達(dá)組（192例），＜33為低表達(dá)組（152 例）；高表達(dá)組患者的中位無(wú)病生存期低于低表達(dá)組（10.81個(gè)月vs.24.40個(gè)月，P＜0.01），見圖3。

Fig.1 The expression of Elafin in different lung cancer data sets in Oncomine database圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中Elafin在不同肺癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

Fig.2 The high expressed Elafin in lung cancer tissues圖2 Elafin在肺癌組織中高表達(dá)

2.3 Elafin 相關(guān)基因的GO 分析 通過(guò)Linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA LUAD 數(shù)據(jù)集中Elafin 的相關(guān)基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示共有7 697 個(gè)相關(guān)基因，其中上調(diào)基因3 748個(gè)，下調(diào)基因3 949個(gè)（圖4A）。通過(guò)GSEA tools 對(duì)Elafin 的相關(guān)基因進(jìn)行了GO 功能注釋，設(shè)置條件為基因最小數(shù)目5，1 000 次模擬，以FDR＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示在GO 生物過(guò)程中，Elafin相關(guān)基因主要在體液免疫反應(yīng)、皮膚發(fā)育、粒細(xì)胞活化、維生素代謝等過(guò)程出現(xiàn)富集（圖4B）；細(xì)胞分布中主要富集于囊腔、細(xì)胞外基質(zhì)、核糖體等部位（圖4C）；分子功能中主要與調(diào)節(jié)肽酶活性有關(guān)（圖4D）。

2.4 Elafin 相關(guān)基因的KEGG 通路富集分析 進(jìn)一步通過(guò)GSEA tools 對(duì)Elafin 的相關(guān)基因進(jìn)行了KEGG 通路富集分析，設(shè)置條件與GO 分析條件一致。結(jié)果顯示，Elafin相關(guān)基因高度富集在白細(xì)胞介素（IL）-17信號(hào)通路、核因子（NF）-κB 信號(hào)通路、蛋白酶體形成、鞘糖脂生物合成等通路，見圖5。

Fig.3 Relationship between Elafin and the survival and prognosis of lung cancer patients圖3 Elafin表達(dá)與肺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

2.5 Elafin 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) Elafin 與Loricrin 角化包膜前體蛋白（Loricrin，LOR）、胱抑素A（cystatin A，CSTA）、絲蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）、小脯氨酸豐富蛋白（small proline rich protein，SPRR）2B、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1（transglutaminase 1，TGM1）、SPRR1B、整合素（involucrin，IVL）、envoplakin（EVPL）、SPRR3、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）等蛋白存在相互作用，見圖6。

3 討論

由于肺癌起病隱匿，早期可沒(méi)有任何典型癥狀，一般難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致治療效果不理想，預(yù)后較差［9］。因此尋找相關(guān)的分子標(biāo)志和靶點(diǎn)為肺癌早期診斷、早期治療提供依據(jù)具有重要意義。Elafin最初被關(guān)注是因其抵抗微生物［10］、抑制炎癥反應(yīng)過(guò)程、減輕炎癥反應(yīng)等作用［11-12］。近些年有文獻(xiàn)報(bào)道了Elafin 在癌癥方面的作用。例如，Elafin 在乳腺癌中低表達(dá)，通過(guò)保護(hù)細(xì)胞周期蛋白E 不被彈性蛋白酶裂解成低分子質(zhì)量的亞型，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［13］。Elafin在高級(jí)別漿液性的卵巢癌中過(guò)表達(dá)，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（MEK-ERK）信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移［6］。目前，關(guān)于Elafin在肺癌中的研究尚罕見。本研究結(jié)果顯示，多個(gè)數(shù)據(jù)集中Elafin 在肺癌組織表達(dá)上調(diào)，qPCR 實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)Elafin 在肺癌組織中高表達(dá)，提示Elafin 可能在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用。生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)Elafin 的肺癌患者總生存率和無(wú)病生存率均較低表達(dá)者降低，提示Elafin 可能是影響肺癌患者預(yù)后的因素之一。與本研究結(jié)果類似，Caruso等［14］研究顯示乳腺癌中Elafin的高表達(dá)導(dǎo)致患者總生存期和無(wú)病生存期縮短。然而，Liu 等［15］報(bào)道在結(jié)腸癌中Elafin 的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性。在黑色素瘤細(xì)胞中，敲降Elafin促進(jìn)了黑色素瘤的增殖能力［7］。Elafin 作為彈性蛋白酶抑制劑，在腸上皮細(xì)胞中多高表達(dá)，考慮到腸上皮細(xì)胞可能接觸的外源物質(zhì)較多，Elafin在結(jié)腸組織中可能更多發(fā)揮抗炎癥的作用；而在黑色素瘤中，本身作為皮膚細(xì)胞表達(dá)的分子之一，Elafin在正常皮膚細(xì)胞中是否參與增殖調(diào)控尚待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。Elafin在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。

Fig.4 GO analysis of Elafin-related genes圖4 Elafin相關(guān)基因GO分析

Fig.5 KEGG analysis of Elafin-related genes圖5 Elafin相關(guān)基因KEGG分析

Fig.6 The protein-protein interaction network of Elafin proteins圖6 Elafin蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

持續(xù)的慢性炎癥反應(yīng)往往是慢性疾病進(jìn)展為癌癥的重要原因之一［16］。慢性肺炎是肺癌的危險(xiǎn)因素［17］。本研究結(jié)果顯示，Elafin 在GO 的生物過(guò)程中參與調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞趨化以及細(xì)胞氧化還原穩(wěn)定等，提示Elafin在肺癌中可能參與了癌癥的炎癥免疫環(huán)境以及細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。分子功能中Elafin 主要富集于調(diào)節(jié)肽酶活性，在細(xì)胞定位中Elafin 主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)、囊腔等。有研究顯示Elafin 可作為分泌蛋白在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用［6］，結(jié)合Elafin在炎癥與免疫中的可能作用，其在肺癌中可能通過(guò)癌細(xì)胞分泌，在胞外利用其肽酶調(diào)節(jié)活性發(fā)揮癌癥微環(huán)境的調(diào)節(jié)功能。另外，在關(guān)于肺癌中Elafin的GO分析中，Elafin相關(guān)基因也顯示了對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞脂質(zhì)、微管等相關(guān)生物過(guò)程與分子功能調(diào)控的潛質(zhì)，可能是Elafin在不同腫瘤中功能不同的原因之一。Elafin相關(guān)基因?qū)?xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞脂質(zhì)、微管等相關(guān)生物過(guò)程與分子功能的調(diào)控尚無(wú)差異可能是設(shè)定分析條件的不同所導(dǎo)致的。在KEGG通路富集分析中，Elafin相關(guān)基因主要富集在IL-17 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路以及藥物代謝等過(guò)程中。IL-17、NF-κB等作為常見的炎癥反應(yīng)信號(hào)分子之一，在多種腫瘤中也常出現(xiàn)上調(diào)，例如IL-17 上調(diào)再通過(guò)刺激腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（metastasis-associated protein，MTA1）表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［18］。Elafin 在肺癌中的作用是否與IL-17、NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，Elafin 與 LOR、CSTA、FLG、SPRR2B、TGM1、SPRR1B、IVL、EVPL、SPRR3、AKT1等蛋白存在相互作用。LOR 作為角化細(xì)胞膜的主要蛋白質(zhì)成分，主要與皮膚病有關(guān)；IVL、EVPL等主要在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮作用；CSTA是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，已有研究提示該家族可作為某些腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物［19］；SPRR1B、SPRR2B、SPRR3 等是富含脯氨酸的小蛋白，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中可能發(fā)揮一定的作用［20］。TGM1 編碼一種膜蛋白，主要參與烷基胺的轉(zhuǎn)移，亦有文獻(xiàn)報(bào)道了TGM1 在促進(jìn)胃癌進(jìn)展中的作用［21］。LOR、IVL、EVPL 等均與皮膚細(xì)胞有關(guān)，提示Elafin 在上皮細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮著一定作用；CSTA、SPRR1B、SPRR2B、SPRR3、TGM1 等均有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力，結(jié)合Elafin 在腫瘤中的研究，Elafin 亦有可能作為腫瘤的潛在標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中Elafin 與AKT1 存在相互作用。AKT1 是PI3K/AKT 信號(hào)的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，腫瘤中PI3K/AKT 信號(hào)的激活可促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移、侵襲 等 多 個(gè) 過(guò) 程［22］。Labidi-Galy 等［6］已經(jīng)證實(shí)Elafin 可通過(guò)增加AKT 蛋白的磷酸化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖遷移。肺癌中Elafin 的表達(dá)與PI3K/AKT信號(hào)通路之間的關(guān)系值得進(jìn)一步關(guān)注。

綜上所述，Elafin 在肺癌中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良有關(guān)。Elafin可能促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，但由于樣本以及數(shù)據(jù)庫(kù)的研究范圍有限，有關(guān)Elafin 在肺癌中的作用及其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。