基于EphrinBs/EphBs通路探討桃紅四物湯治療帶狀皰疹后遺神經痛大鼠模型的作用機制

徐俊濤，王麗△，王瑩，馬飛，方玉甫

帶狀皰疹是一種常見的由水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）所引起的急性皮膚病，而帶狀皰疹后遺神經痛（postherpetic neuralgia，PHN）是帶狀皰疹最常見的并發癥之一，其中痛覺過敏、自發痛和誘發痛是其主要癥狀，給患者身心健康和生活質量造成了極大困擾［1-2］。桃紅四物湯是活血養血的經典方，具有調經鎮痛、抗炎、提高免疫力和促進骨折愈合等作用［3］。近年有報道指出桃紅四物湯在治療PHN方面療效滿意［4-5］，但其具體作用機制尚不明確。EphBs 是酪氨酸激酶亞家族成員，可與其配體EphrinBs結合組成EphrinBs/EphBs信號通路，在軸突導向、突觸可塑性、血管再生和組織邊緣形成等方面發揮著重要作用，與神經病理性疼痛密切相關［6］。EphrinBs/EphBs 信號通路是否參與桃紅四物湯改善PHN 的分子機制并不清楚。本研究基于EphrinBs/EphBs通路，探討桃紅四物湯對PHN模型大鼠的治療效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級健康雄性SD大鼠，6周齡，體質量160～200 g，購自廣西醫科大學動物科學實驗中心，合格證號：SYXK 桂2014-003。大鼠在濕度為（50±10）%、溫度為（24±2）℃和光照周期為10 h的環境下自由進食和飲水，飼養期間無噪音和強光刺激。本研究動物實驗已通過河南省中醫院倫理委員會批準，實驗操作過程均符合實驗動物的倫理條例。

1.2 藥品、試劑與儀器 桃紅四物湯組分：熟地黃、白芍、當歸、川芎和桃仁各9 g，紅花6 g均購自河南省中醫院大藥房，以10 倍量的75%乙醇回流提取2 h，再以8 倍量的75%乙醇回流提取2 h，將2 次提取液合并濃縮成生藥濃度為1 g/mL。普瑞巴林膠囊（國藥準字H20130073）購自重慶賽維藥業有限公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）試劑盒購自瑞士Roche 公司，腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒和全蛋白提取試劑盒購于北京索萊寶生物公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，EphrinB2-Fc 和EphB2-Fc 購自美國Sigma 公司，EphrinB2、EphB2 和β-actin 抗體購自美國Santa Cruz 公司，放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液購自上海信帆生物科技有限公司，凝膠成像分析系統（型號：SYSTEM GelDoc XR+）購自美國Bio-Rad公司，電子測痛儀（型號：Von Frey）購自上海玉研科學儀器有限公司。

1.3 PHN模型構建 采用隨機數字表法取10只大鼠作為空白組，剩余50 只大鼠應用VZV 慢性感染法［7］構建PHN 大鼠模型。具體步驟如下：采用DMEM/F12 完全培養基將CV-1細胞（美國ATCC）制成細胞懸液，按照5×104個/cm2細胞密度接種至培養瓶中；以VZV 感染CV-1 細胞，感染2 d 至約80%細胞被感染時，以磷酸緩沖液將被感染細胞制成細胞懸液；將含VZV 的細胞懸液50 μL 以1.2×108/mL 接種至SD 大鼠左趾蹼中，空白組大鼠左趾蹼注射等量生理鹽水；待接種3～4 d后大鼠出現機械痛閾值異常時證明PHN大鼠模型構建成功。

1.4 實驗分組與給藥處理 50只PHN模型大鼠采用隨機數字表法分為5 組（n=10）：（1）模型組。造模第3 天以15 mg/（kg·d）生理鹽水灌胃。（2）陽性組。造模第3 天以普瑞巴林27 mg/（kg·d）灌胃。（3）治療組。造模第3天以桃紅四物湯5 g/（kg·d）灌胃。（4）治療+EphB2-Fc 組。造模第3 天鞘內注射EphB2-Fc 5 μg 后，以桃紅四物湯5 g/（kg·d）灌胃。（5）治療+EphrinB2-Fc 組。造模第3天鞘內注射EphrinB2-Fc 5 μg后，以桃紅四物湯5 g/（kg·d）灌胃。另空白組以15 mg/（kg·d）生理鹽水灌胃，各組按照劑量連續給藥14 d。

1.5 行為學實驗測定大鼠機械痛閾值 采用電子測痛儀分別在給藥后1 d、7 d和14 d時對各組大鼠進行機械痛閾值測定。將大鼠置于底部為金屬網的透明玻璃箱內適應30 min并處于平靜狀態后，開始測試。將儀器探頭尖端垂直輕柔地刺激大鼠后足底部，逐漸增加刺激力度，當大鼠出現縮足、舔足和彈退等行為時，記錄電子測痛儀顯示的最大值。其中，每間隔5 min檢測1次，連續檢測3次。

1.6 ELISA 法檢測脊髓組織中IL-1β 和TNF-α 水平 在機械痛閾值檢測結束后，將大鼠斷頭處死，取L4～L6脊髓組織，分為四部分：第一部分置于液氮中凍存30 min 后放入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）實驗；第二部分以4% 多聚甲醛固定；第三部分用于檢測脊髓組織Caspase-3 活性；第四部分加入9 倍的生理鹽水制成勻漿，1 000 r/min 離心10 min 后，參照ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α水平。

1.7 TUNEL 法檢測脊髓神經細胞凋亡 取4%多聚甲醛固定后的脊髓組織，行5 μm 厚常規石蠟切片。經脫蠟和水化后，加入20 g/L蛋白酶K在37 ℃下消化30 min。以磷酸緩沖液洗滌5 min，重復3 次后，在37 ℃下以20 μL 小牛血清封閉15 min，再加入20 μL TUNEL 反應液37 ℃孵育1 h。經磷酸緩沖液洗滌后，以0.3%H2O2孵育10 min；以磷酸緩沖液洗滌后，采用正常羊血清在37 ℃下封閉15 min，然后在37 ℃下以辣根過氧化物酶孵育30 min。經磷酸緩沖液洗滌后，二氨基聯苯胺顯色，并以自來水沖洗使反應終止，再以磷酸緩沖液洗滌。經脫水、透明和封片后，采用高倍顯微鏡隨機讀取5個視野計數，細胞凋亡指數=（凋亡細胞數/總細胞數）×100%。

1.8 熒光分光光度計法檢測脊髓組織Caspase-3活性 取各組大鼠L4～L6 脊髓組織，參照Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書，采用熒光分光光度計在535 nm 發射波長與485 nm 激發波長處檢測熒光強度，結果以實驗組與對照組熒光強度的比值表示Caspase-3活性。

1.9 Western blot 檢測脊髓組織中EphrinB2和EphB2的蛋白相對表達量 取L4～L6 脊髓組織，加入RIPA 裂解液制成勻漿，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白后，采用BCA法檢測總蛋白濃度與純度。將符合要求的蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混合后，置于沸水浴中煮沸5 min。將變性后的蛋白樣品按照每孔60 μg 上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上行電泳分離。待電泳結束后，轉至聚偏氟乙烯膜上。經5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入EphrinB2抗體（1∶100）、EphB2抗體（1∶100）和β-actin抗體（1∶1 000）4 ℃下孵育24 h。經磷酸緩沖液洗膜5 min×3 次后，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h。磷酸緩沖液洗膜后，加入化學發光劑暗室內顯影曝光。采用凝膠成像分析系統掃描分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PHN 大鼠機械痛閾值的比較 與空白組比較，PHN 模型大鼠在給藥后相同時間下機械痛閾值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，給予桃紅四物湯治療的大鼠在給藥后1 d 時機械痛閾值差異無統計學意義（P＞0.05），但在給藥后7 d 和14 d 時機械痛閾值均明顯升高（P＜0.05）。給藥后7 d和14 d時與治療組相比，給予EphBs阻滯劑EphB2-Fc后大鼠機械痛閾值明顯升高，而給予EphBs 激動劑EphrinB2-Fc 后大鼠機械痛閾值明顯降低（P＜0.05），見表1。

2.2 各組PHN 大鼠脊髓組織中炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平的比較 與空白組比較，PHN 模型大鼠脊髓組織中IL-1β 和TNF-α 水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，給予桃紅四物湯治療后大鼠脊髓組織中IL-1β 和TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.05）；與治療組比較，給予EphBs 阻滯劑EphB2-Fc后大鼠脊髓組織中IL-1β 和TNF-α 水平均明顯降低，而給予EphBs 激動劑EphrinB2-Fc 后IL-1β 和TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of mechanical pain thresholds between six groups of rats表1 6組大鼠機械痛閾值比較 （n=10，g，x±s）

Tab.2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord tissues between six groups表2 6組大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α水平比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord tissues between six groups表2 6組大鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α水平比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與治療組比較，e與治療+EphB2-Fc組比較，P＜0.05

組別空白組模型組陽性組治療組治療+EphB2-Fc組治療+EphrinB2-Fc組F IL-1β 3.29±0.20 9.62±1.52a 4.96±1.15ab 6.83±1.23abc 4.08±1.02bd 9.52±1.15acde 59.476＊＊TNF-α 10.54±1.38 26.73±3.25a 13.36±2.19ab 18.65±2.03abc 13.12±1.10bd 23.26±2.12abcde 90.542＊＊

2.3 各組PHN 大鼠脊髓神經細胞凋亡的比較 與空白組比較，PHN 模型大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3 活性均明顯升高（P＜0.05）；給予桃紅四物湯處理后大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3 活性較模型組均明顯降低（P＜0.05）；與治療組比較，給予EphBs阻滯劑EphB2-Fc后大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3活性均明顯降低，而給予EphBs 激動劑EphrinB2-Fc 后大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3 活性均明顯升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of apoptosis index and Caspase-3 activity of spinal neurons between six groups表3 6組大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3活性比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis index and Caspase-3 activity of spinal neurons between six groups表3 6組大鼠脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3活性比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與治療組比較，e與治療+EphB2-Fc組比較，P＜0.05

組別空白組模型組陽性組治療組治療+EphB2-Fc組治療+EphrinB2-Fc組F凋亡指數（%）2.30±0.10 15.06±2.13a 6.82±1.36ab 9.17±2.51ab 5.54±2.02abd 12.68±2.16acde 62.077＊＊Caspase-3活性1.00±0.00 3.28±0.23a 1.56±0.18ab 2.02±0.12abc 1.25±0.12abcd 2.87±0.10abcde 401.457＊＊

2.4 各組PHN 大鼠脊髓組織中EphrinBs/EphBs 通路相關蛋白表達水平的比較 與空白組比較，PHN模型大鼠脊髓組織中EphrinBs/EphBs通路相關蛋白EphrinB2 和EphB2 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，給予桃紅四物湯治療后大鼠脊髓組織中EphrinB2和EphB2蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與治療組比較，給予EphBs 阻滯劑EphB2-Fc 后大鼠脊髓組織中EphrinB2 和EphB2 蛋白表達水平均降低；給予EphBs激動劑EphrinB2-Fc后大鼠脊髓組織中EphrinB2 蛋白表達水平明顯降低，而EphB2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），見圖1、表4。

Fig.1 Western blot analysis of EphrinB2 and EphB2 protein expression in spinal cord圖1 Western blot檢測脊髓組織中EphrinB2和EphB2蛋白表達

Tab.4 Comparison of protein expression levels of EphrinB2 and EphB2 in spinal cord of rats between six groups表4 6組大鼠脊髓組織中EphrinB2和EphB2蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of protein expression levels of EphrinB2 and EphB2 in spinal cord of rats between six groups表4 6組大鼠脊髓組織中EphrinB2和EphB2蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與模型組比較，c與陽性組比較，d與治療組比較，e與治療+EphB2-Fc組比較，P＜0.05

組別空白組模型組陽性組治療組治療+EphB2-Fc組治療+EphrinB2-Fc組F EphrinB2 0.07±0.02 0.35±0.03a 0.12±0.02ab 0.18±0.02abc 0.15±0.02abcd 0.06±0.02bcde 232.345＊＊EphB2 0.23±0.02 0.67±0.04a 0.36±0.03ab 0.45±0.03abc 0.35±0.03abd 0.78±0.06abcde 318.843＊＊

3 討論

PHN 是一種與脊髓、脊髓上中樞敏化和外周神經敏化等有關的頑固性病理性神經疼痛，多見于中老年人。目前，臨床上使用的阿片類藥、非甾體類抗炎藥和三環類抗抑郁藥等各種鎮痛藥對PHN 的治療效果甚微，且多存在不良反應［8］。PHN 屬于中醫學“蛇丹愈后痛”范疇，被認為是濕熱毒邪內侵，蘊結于內，年老者氣血虧虛，毒邪不散所致的氣血凝滯，經絡不通等。桃紅四物湯是活血養血經典方，源自《醫宗金鑒》，具有養血、活血祛瘀的功效，由四物湯加桃仁和紅花構成，方中熟地與當歸養血活血為君藥；川芎活血行滯，白芍斂陰養血，紅花、桃仁破血行瘀，祛瘀生新，共為臣藥［9］。作為中醫傳統經典方劑，桃紅四物湯在治療PHN方面的作用逐漸引起關注。有研究發現，95例PHN的患者內服桃紅四物湯后總有效率為86.9%［10］。另有研究顯示，桃紅四物湯可通過抑制炎癥反應緩解PHN［11］。然而，桃紅四物湯改善PHN的具體機制尚不明確。

VZV 感染CV-1 細胞后經皮下注射大鼠左趾蹼是目前研究PHN常用的造模方法［12-13］。本研究采用該方法造模后模型組大鼠機械痛閾值明顯降低；給予桃紅四物湯7 d 和14 d 后可使機械痛閾值明顯升高，表明PHN 大鼠模型構建成功，桃紅四物湯具有減輕PHN 疼痛的作用。在PHN 患者血清中炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平呈過度表達狀態［14-15］，而高水平的TNF-α和IL-1β可通過刺激炎性細胞產生炎性介質，對神經系統造成損傷，進而引起疼痛。崔玉蓬等［16］研究發現，桃紅四物湯可通過降低IL-1β 和TNF-α水平有效減輕急性腰椎間盤突出癥患者疼痛的癥狀。本研究結果顯示，PHN 模型大鼠脊髓中IL-1β 和TNF-α 水平較空白組明顯升高，而以桃紅四物湯治療后IL-1β 和TNF-α 水平明顯降低，提示桃紅四物湯可通過降低脊髓中IL-1β和TNF-α水平減輕炎癥損傷，改善PHN大鼠疼痛。在神經病理性疼痛發生過程中，神經細胞凋亡是疼痛發生的重要機制［17］。de Novellis 等［18］研究證實，抑制脊髓背角凋亡狀態，可減輕疼痛。陳云婷等［19］研究指出，在構建的PHN 小鼠脊髓組織中凋亡執行因子Caspase-3表達升高，脊髓神經細胞凋亡明顯增多；夏天無注射液可通過抑制小鼠脊髓神經細胞凋亡發揮改善PHN脊髓疼痛的作用。本研究結果顯示，PHN 模型大鼠脊髓中Caspase-3 活性和神經細胞凋亡指數較空白組明顯升高；給予桃紅四物湯治療后，Caspase-3 活性和神經細胞凋亡指數明顯降低，提示桃紅四物湯可抑制脊髓神經細胞凋亡，可能是其改善PHN疼痛的重要機制。

EphrinBs/EphBs 通路的激活可通過促進脊髓后角廣動力范圍型神經元和傷害性脊神經節興奮，誘導中樞致敏；同時，還可使下游絲裂原活化蛋白激酶通路活化，在傷害性信息調制方面發揮著重要作用［6，20］。本研究結果顯示，PHN 模型大鼠脊髓組織中EphrinBs/EphBs 通路相關蛋白EphrinB2 和EphB2蛋白表達水平較空白組明顯升高，給予桃紅四物湯治療可明顯降低EphrinB2 和EphB2 蛋白表達水平，提示桃紅四物湯可抑制PHN 模型大鼠脊髓組織中EphrinBs/EphBs 通路活化。Liu 等［21］研究顯示鞘內注射EphBs 激動劑EphrinB2-Fc 使EphrinBs/EphBs通路激活，可升高IL-1β和TNF-α水平，加重炎癥損傷；反之，以注射EphBs 阻滯劑EphB2-Fc 抑制EphrinBs/EphBs 通路活化可降低IL-1β 和TNF-α 水平，減輕炎癥損傷。楊梅等［20］研究發現，以鞘內注射EphrinB2-Fc 可使脊髓背角Caspase-3 活性升高，脊髓背角神經元的凋亡增多，疼痛閾值降低；而EphB2-Fc 可使脊髓背角Caspase-3 活性降低，脊髓背角神經元的凋亡減少，疼痛閾值升高，提示桃紅四物湯可能通過抑制EphrinBs/EphBs通路活化減輕脊髓組織炎癥損傷和神經細胞凋亡而發揮緩解PHN疼痛的作用。本研究在給予桃紅四物湯治療的基礎上進一步在鞘內注射EphB2-Fc 和EphrinB2-Fc，以評價EphrinBs/EphBs在桃紅四物湯改善PHN疼痛中的作用，結果顯示，EphB2-Fc 在阻滯EphrinBs/EphBs 通路活化的同時，還可使桃紅四物湯減輕PHN 大鼠疼痛的作用進一步增強，脊髓中IL-1β 和TNF-α 水平進一步降低，脊髓神經細胞凋亡指數和Caspase-3活性進一步降低；反之，給予EphrinB2-Fc處理后，則呈現出與EphB2-Fc 相反的結果，提示EphB2-Fc 可增強桃紅四物湯對PHN 大鼠的改善作用，而EphrinB2-Fc 可逆轉桃紅四物湯對PHN 大鼠的改善作用；桃紅四物湯可通過抑制EphrinBs/EphBs 通路減輕脊髓炎癥損傷和神經細胞凋亡，進而發揮減輕PHN大鼠疼痛的作用。