巨噬細胞外泌體通過抑制自噬誘導高血糖對腎小球足細胞的損傷作用

饒超峰，薛笑楠，朱明英，羅富里

腎小球足細胞損傷與糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的發生發展密切相關［1-2］。最近發現，腎小球足細胞增殖和蛋白尿與自噬抑制有關［3］。有研究表明，鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導的糖尿病小鼠足細胞自噬不足，并伴有大量蛋白尿；而在基礎代謝條件下，足細胞中高水平的自噬與細胞內穩態正相關［4］。然而，高糖（high glucose，HG）環境如何介導腎小球足細胞自噬尚不清楚。以往研究表明，HG 環境通過激活核因子（NF）-κB 信號通路，產生大量的促炎介質，如轉化生長因子-β1、單核細胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-1β，促進巨噬細胞遷移和活化，進而導致腎臟損傷［5］。這些發現強調了HG 在巨噬細胞活化中的作用。巨噬細胞具有招募免疫細胞的能力，其在DN進展過程中起著中心作用，但是在糖尿病狀態下巨噬細胞和足細胞之間的通訊機制尚有待闡明。外泌體（Exosomes，Exos）是一類大小為30～120 nm的小膜泡，在細胞間通訊和相關免疫細胞激活中發揮作用［5］。Exos 具有改變靶細胞表型和功能的能力［5］。巨噬細胞來源的Exos 可以誘導靶細胞活化和分化［6］。最近研究觀察到，HG誘導的巨噬細胞Exos通過NF-κB 信號途徑激活巨噬細胞并誘導炎癥反應［7］。但HG誘導的巨噬細胞Exos是否與DN足細胞損傷有關尚未明確。鑒于此，本研究觀察HG處理的Raw264.7 巨噬細胞來源的Exos 對足細胞的損傷作用，并探討其作用機制是否與抑制足細胞自噬相關。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 小鼠巨噬細胞系Raw264.7和原代足細胞購自中國科學院細胞庫。DMEM 培養基、RPMI 1640 培養基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素、氯喹、雷帕霉素、綠色親脂熒光染料PKH67 購自美國Sigma 公司；外泌體提取試劑ExoQuick-TC、EXOCET Exosome 定量試劑盒購自美國System Biosciences 公司；Phalloidin-iFluor 594 試劑、兔抗Nephrin 抗體、兔抗LC3B、Calnexin、p62、p-mTOR、mTOR單克隆抗體購自英國Abcam公司；CD63、CD9、GAPDH單克隆抗體和HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司；Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司。H-7700透射電子顯微鏡（TEM）購自日本Hitachi 公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss 公司；NOVA 超顯微切片機購自瑞典Pharmacia LKB 公司；Tanon 5200 Multi全自動化學發光/熒光圖像分析系統購自上海天能科技有限公司；Safire2酶標儀購自瑞士TECAN公司。

1.2 細胞培養和實驗分組 小鼠巨噬細胞系Raw264.7和原代足細胞分別接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L 鏈霉素的低葡萄糖DMEM 培養基或RPMI 1640 培養基中。細胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中常規培養，當細胞融合度達70%～80%時，更換新的培養基，完成一次細胞傳代。取對數生長期細胞用于實驗。（1）將Raw264.7 細胞分別用正常葡萄糖（NG；5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇）組和高糖（HG；30 mmol/L 葡萄糖）處理48 h，探討HG 對Raw264.7 細胞釋放Exos 的影響。（2）原代足細胞用HG 提取不同劑量的Exos（0、7、14、28、56、112 mg/L）處理，對照組加入等量溶媒，探討高糖外泌體（HG-Exos）對足細胞存活、自噬的影響。（3）原代足細胞用HG-Exos（28 mg/L）處理不同時間（0、6、12、24、48、72、96 h），對照組加入等量溶媒，探討HGExos對足細胞存活的影響。（4）將原代足細胞分為6組：對照組（加入100 μL PBS）、HG-Exos組（加入100 μL 28 mg/L HGExos）、氯喹（自噬抑制劑，CQ）組（加入100 μL 10 μmol/L CQ）、HG-Exos+氯喹組（加入100 μL 28 mg/L HG-Exos 和100 μL 10 μmol/L CQ）、雷帕霉素（自噬誘導劑，Rapamycin）組（加入100 μL 100 μg/L Rapamycin）、HG-Exos+雷帕霉素組（加 入100 μL 28 mg/L HG-Exos 和100 μL 100 μg/L Rapamycin），探討HG-Exos誘導的細胞毒性是否會受到自噬調節劑的影響。

1.3 Exos 提取及TEM 觀察 將NG 組和HG 組Raw264.7 細胞按1×106/mL 接種于培養皿中，培養24 h，收集細胞，并以3 000×g離心15 min以去除細胞和細胞碎片。將3.3 mL外泌體提取試劑ExoQuick-TC 加到10.0 mL 上清液中，并將混合物在4 ℃冷藏過夜（至少12 h）。然后1 500×g離心30 min，取上清液，再通過1 500×g離心5 min將剩余的ExoQuick-TC 溶液離心去除。使用EXOCET Exosome 定量試劑盒定量Exos。將純化的Exos 沉淀物在無菌PBS中稀釋，并將10 μL懸浮液在室溫下置于銅網上2 min。然后將Exos 用2%磷鎢酸染色5 min，并用2%戊二醛固定5 min，然后用PBS 洗滌3 次。用H-7700 TEM觀察。

1.4 Exos 在原代足細胞的內化 采用綠色親脂熒光染料PKH67 標記HG 組Raw264.7 源Exos（HG-Exos）。然后，將標記PKH67 的Exos 與原代足細胞共培養24 h，4%多聚甲醛固定10 min，1%牛血清白蛋白封閉1.5 h。隨后，在PBS 中用50 mg/L Phalloidin-iFluor 594 試劑染色在室溫下染色足細胞40 min。最后用DAPI染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡對原代足細胞進行檢測和拍照。

1.5 TEM觀察自噬體 將按1.2中（2）、（4）的分組處理足細胞以2×105/孔接種在96 孔板中，將足細胞用4%戊二醛固定12 h，再用1%OsO4固定2 h，梯度乙醇（體積分數50%、70%、90%）脫水，70%醋酸鈾染色6 h，乙醇脫水，環氧樹脂包埋3 h，將樣品置于60 ℃烘箱中48 h，并進行切片，厚度70 nm。最后用2%（W/V）醋酸鈾和檸檬酸鉛對樣品進行染色，用TEM觀察自噬體。

1.6 CCK-8法測定HG-Exos 對細胞活力的影響 將足細胞以2×105/孔接種在96孔板中，按1.2中（2）、（3）的分組處理足細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育1 h。然后使用Safire2 酶標儀通過測量450 nm 的光密度（OD）確定細胞活力。計算公式：細胞活力（%）=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（對照）-OD（空白）］×100%。

1.7 Western blot 檢測自噬相關蛋白的表達 取足細胞或Exos，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白質，混勻后冰上裂解15 min。在4 ℃以12 000×g 離心20 min，收集上清液。用Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質濃度。將蛋白質樣品（50 μg）加載在12%聚丙烯酰胺凝膠上，然后電泳轉移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜，與抗Calnexin（1∶1 000）、抗CD63（1∶1 000）、抗CD9（1∶1 000）、抗LC3B（1∶2 000）、抗Nephrin（1∶2 000）、抗Beclin 1（1∶2 000）、抗p62（1∶2 000）、抗p-mTOR（1∶2 000）、抗mTOR（1∶2 000）和GAPDH（1∶15 000）的一抗于4 ℃孵育過夜。次日，在室溫下與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）孵育2 h。最后用Tanon 5200 Multi全自動化學發光成像分析系統發光顯影。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Bonferroni校正法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HG處理的Raw264.7細胞分泌Exos特征 TEM顯示，Raw264.7 細胞分泌的Exos 呈圓形的膜囊泡，直徑為30～100 nm，且NG 組和HG 組的Raw264.7 細胞分離出Exos 在形態學上無明顯差異，見圖1。Western blot結果顯示，提取的Exos均表達特征性外泌體標志物CD63 和CD9，而不表達內質網標志物Calnexin（常與細胞碎片有關），分離的Exos 未被細胞污染，見圖2。HG組Raw264.7細胞釋放的Exos數量（5.88±0.31）×108顯著多于NG 組的（1.84±0.26）×108（n=3，t=3.146，P＜0.05）。在TEM下觀察到HG組PKH67 標記的Exos 位于足細胞的核周區中，表明Exos可以內化到足細胞中，見圖3。

Fig.1 The Exos extracted from RAW264.7 cells observed by TEM(×150 000)圖1 TEM觀察Raw264.7細胞提取的Exos（×150 000）

Fig.2 The expressions of Calnexin,CD9 and CD63 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測Exos蛋白標志物Calnexin、CD9和CD63的表達

2.2 HG-Exos 誘導足細胞損傷的劑量和時間依賴性 足細胞活性在HG-Exos刺激后隨劑量和時間的增加而降低。當HG-Exos劑量≥7 mg/L時HG-Exos組細胞活力均低于對照組（P＜0.05），當HG-Exos 劑量為28 mg/L時，細胞活力下降至51.8%±4.0%，見表1，將7 mg/L、14 mg/L 和28 mg/L 作為后續的干預劑量。當作用時間≥12 h時，HG-Exos組細胞活力均低于對照組，當HG-Exos作用時間為48 h時，細胞存活率下降至52.3%±3.4%，見表2，將48 h作為后續干預時間。

Fig.3 Exos secreted by Raw264.7 cells were internalized by podocytes(immunofluorescence staining,×500;Scale=50 μm)圖3 Raw264.7細胞分泌Exos被足細胞內化（免疫熒光染色，×500；比例尺=50 μm）

Tab.1 The cell viability of podocytes at different concentrations of HG-Exos determined by CCK-8 method表1 2組經CCK-8法測定不同HG-Exos劑量干預后足細胞的細胞活力 （n=3，%，±s）

Tab.1 The cell viability of podocytes at different concentrations of HG-Exos determined by CCK-8 method表1 2組經CCK-8法測定不同HG-Exos劑量干預后足細胞的細胞活力 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05

組別對照組HG-Exos組t 0 mg/L 100.0±1.0 100.0±1.0 0.350 7 mg/L 99.0±1.5 80.0±3.6 2.264＊14 mg/L 100.0±1.2 61.0±2.5 3.051＊組別對照組HG-Exos組t 28 mg/L 101.0±1.3 50.0±2.8 3.433＊56 mg/L 100.0±1.1 35.0±3.3 4.579＊112 mg/L 100.0±1.0 11.0±2.4 5.837＊

Tab.2 The cell viability of podocytes exposed to HGExos at different time points determined by CCK-8 method圖2 2組經CCK-8法測定不同HG-Exos干預時間后足細胞的細胞活力 （n=3，%，±s）

Tab.2 The cell viability of podocytes exposed to HGExos at different time points determined by CCK-8 method圖2 2組經CCK-8法測定不同HG-Exos干預時間后足細胞的細胞活力 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05

組別對照組HG-Exos組t 0 h 100.0±1.0 100.0±1.5 0.292 6 h 99.0±1.3 91.0±2.0 1.345 12 h 101.0±1.1 82.0±3.2 3.362＊24 h 100.0±1.2 67.0±2.3 4.178＊組別對照組HG-Exos組t 48 h 100.0±1.0 52.0±2.8 4.178＊72 h 101.0±1.0 41.0±3.5 4.765＊72 h 101.0±1.2 35.0±2.4 5.193＊

2.3 HG-Exos 通過抑制自噬誘導足細胞損傷 Western blot 結果顯示，與0 mg/L HG-Exos 組比較，7 mg/L、14 mg/L 和28 mg/L HG-Exos 組足細胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），見圖4。TEM 顯示，與0 mg/L HG-Exos組（7.7±1.0）比較，7 mg/L（5.4±0.8）、14 mg/L（3.8±0.7）和28 mg/L（1.8±0.4）HG-Exos 組含有雙層膜結構的自噬小體數量均顯著減少（F=32.163，P＜0.05），見圖5。

2.4 自噬對HG-Exos 細胞毒性的影響 Western blot 結果顯示，HG-Exos 組、氯喹組、HG-Exos+氯喹組Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達水平均明顯低于對照組（均P＜0.05）；雷帕霉素組、HG-Exos+雷帕霉素組Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達水平明顯高于HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組（P＜0.05）；HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖6。TEM顯示，各組間自噬體數量差異有統計學意義（F=95.092，P＜0.05）。HG-Exos 組（1.60±0.45）、氯喹組（1.51±0.42）、HG-Exos+氯喹組（0.84±0.24）自噬體數量明顯少于對照組（7.22±1.34），雷帕霉素組（11.16±1.03）、HG-Exos+雷帕霉素組（6.96±0.87）自噬體數量明顯多于HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組（P＜0.05）；HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組自噬體數量差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖7。

Fig.4 Effects of different concentrations of HG-Exos on the expressions of LC3B，Beclin 1 and Nephrin autophagy related proteins in podocytes detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測不同劑量HG-Exos對足細胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達的影響

Fig.5 Effects of different concentrations of HG-Exos on autophagy detected by transmission electron microscope (×60 000)圖5 TEM觀察不同劑量HG-Exos對自噬小體的影響（×60 000）

Fig.6 The effects of chloroquine,rapamycin and HG-Exos on the expressions of LC3B,Beclin 1 and Nephrin autophagy related proteins in podocytes detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測6組足細胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白的表達

Fig.7 The effects of chloroquine,rapamycin and HG-Exos on autophagy detected by transmission electron microscope(×60 000)圖7 TEM觀察氯喹、雷帕霉素和HG-Exos對自噬體的影響（×60 000）

3 討論

巨噬細胞是體內外介導腎臟炎癥反應最重要的免疫細胞之一［8］。有研究顯示，糖尿病小鼠腎臟巨噬細胞的活化與高血糖、糖化血紅蛋白、蛋白尿、腎小球和腎小管損傷程度呈正相關［9-10］。此外，糖尿病大鼠模型實驗證實了巨噬細胞誘導的信號傳導與腎損傷嚴重程度密切相關［11］。但是,在糖尿病狀態下巨噬細胞和腎小球足細胞之間的通訊機制尚有待闡明。近年來，越來越多的證據表明，在生理和病理條件下，Exos可以將功能分子轉移到靶細胞上，并充當細胞間聯系的介質［12］。本研究結果顯示，HG處理的Raw264.7細胞產生的Exos數量明顯多于NG處理的Raw264.7細胞，且HG-Exos 可以劑量和時間依賴的方式降低足細胞的細胞活力；此外，與對照組相比，HG-Exos 降低了足細胞中Beclin 1、LC3B蛋白表達水平，并減少了自噬小體數量，提示HG-Exos具有通過減少自噬而損傷足細胞的能力。以上結果表明在糖尿病中，Exos 介導巨噬細胞與足細胞的相互作用，參與DN的發病機制。足細胞是位于腎小球基底膜的高度分化的細胞，參與維持腎小球濾過屏障，所有形式的腎病綜合征均以足細胞異常為特征［13］。足細胞狹縫橫隔膜控制著腎小球濾過屏障的結構和功能。由狹縫橫隔膜表達的Nephrin 蛋白對濾過屏障的完整性具有重要作用，其可作為足細胞的標志物，并已被證實與蛋白尿有關［14］。本研究結果顯示，7 mg/L、14 mg/L和28 mg/L HG-Exos刺激后，Nephrin蛋白表達水平明顯低于0 mg/L HG-Exos 組，提示HG-Exos刺激后足細胞出現損傷跡象。

自噬是一種高度保守的溶酶體途徑，參與受損細胞器的清除。自噬失調導致多種疾病的發病，包括癌癥、神經變性、心臟病和某些腎臟疾病［15］。近年來研究表明，足細胞中自噬的激活可能是預防DN進展的潛在治療選擇［16-17］。以往研究證明了可通過增強自噬水平對HG 誘導的細胞損傷發揮保護作用［18］。Beclin 1和LC3B是調節自噬體膜的必需蛋白質。LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值與自噬體數目呈正相關。上調Beclin 1、LC3B 蛋白表達可減輕HG-Exos對足細胞的損傷。據報道，抑制自噬與足細胞去分化有關，自噬缺陷促進足細胞損傷［19］。本研究結果顯示，與對照組相比，HG-Exos刺激可以劑量依賴的方式導致自噬體數量減少，提示HG-Exos 的劑量上調與自噬的下調有關，從而導致足細胞損傷。為了進一步研究HG-Exos對自噬介導的足細胞損傷的抑制作用，采用自噬抑制劑氯喹或mTOR 抑制劑雷帕霉素與HG-Exos 進行聯合處理。結果顯示，HGExos+雷帕霉素組Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達水平以及自噬體數量明顯高于HG-Exos 組，提示雷帕霉素可減弱HG-Exos 的細胞毒性。因此，再次驗證HG-Exos通過降低足細胞內的自噬水平誘導細胞損傷。

綜上所述，HG 誘導的巨噬細胞Exos 可以劑量和時間依賴性地降低細胞活力和增加足細胞損傷。此外，HG 誘導的巨噬細胞Exos 能有效地降低足細胞自噬，誘導足細胞損傷，雷帕霉素聯合治療可挽救足細胞損傷。本研究為HG誘導的巨噬細胞Exos引起腎損傷提供了一個新的治療靶點，但尚需進一步闡明參與自噬激活的特定分子機制和信號途徑。