尾靜脈移植骨髓間充質干細胞治療腦缺血損傷大鼠的研究

張向群, 王新平, 景文莉

急性腦缺血后,因缺血灶神經細胞死亡而導致的神經功能缺損至今仍缺乏真正有效的治療措施和藥物,九十年代初神經干細胞的發現,打破了神經元不能再生的傳統觀念,為中樞神經系統的損傷修復注入了新的活力。但由于神經干細胞取材、培養困難,而且有免疫排斥、來源受限、倫理道德的約束限制了其進一步應用。而骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells MSCs)具有取材、培養方便,可取自體骨髓進行自體移植,并有多種分化潛能等優點,具有良好的臨床應用前景。本實驗旨在通過尾靜脈途徑移植 MSCs觀察在大鼠腦缺血再灌注損傷中的治療效果,探討可能的治療機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年 SD(Sprague-Dawley)大鼠,體重分別為 140～160g和 260～280g,雄性,由中國軍事醫學科學院動物中心(北京)提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 5'-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU,MP Med Biochemicals生產);大鼠立體定向儀(西安西北光電儀器制造有限公司制造);鼠抗人尿嘧啶脫氧核苷(Brdu)單克隆抗體(中杉公司);兔抗人神經元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(中杉公司);兔抗人膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(中杉公司);腦源性神經營養因子(BDNF)多克隆抗體(博士德公司);切片機 (MicroM HM325德國);圖像采集 Olympus顯微鏡(北京航空航天大學圖像采集軟件)

1.2 實驗方法

1.2.1 MSCs的分離和培養及誘導 用斷頸法急性處死 SD大鼠并消毒,無菌條件下取股骨及脛骨。用 MSCs標準培養液沖洗骨髓腔,沖出細胞懸液離心,棄上清液,小心疊加到密度為 1.077的 Ficoll-Paque淋巴細胞分離液上層,取單個核細胞層,以 106/cm2密度接種到 75cm2培養瓶中培養。隔日全量換液。待原代細胞生長至瓶底的 80%～90%時,用 0.25%胰蛋白酶液和 0.02%EDTA液消化細胞,離心后重新加入標準培養液懸浮細胞,以 1∶1比例傳代細胞。

1.2.2 MCAO動物模型 用改良 Zea Longa's線栓法阻斷左側大腦中動脈(MCAO)制成局灶性腦缺血模型,1h后拔線栓再灌注。模型成功的判定:右側肢體癱瘓,以前肢為重。表現為提尾時大鼠右前肢屈曲,內收;或者行走時向右側轉圈或傾倒。

1.2.3 神經功能缺損評分(NSS) 神經功能缺失評分根據 Z.Speise的方法,此評分共 12項,總分 16分,完全正常鼠 =0分,完全功能缺失 =16分,大部分存活鼠梗死后功能評分為 12～14分。

1.2.4 MSCs的移植 制作模型成功后的 7d通過通過尾靜脈注射 1×106Brdu標記的 MSCs細胞,對照組不接種。

1.2.5 腦組織石蠟切片制備及免疫組化染色

在不同時間點殺鼠后用 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液 300ml灌注固定,取腦后置于固定液中 24h以上。常規石蠟切片以備 HE染色、免疫組織化學染色。

2 結 果

2.1 骨髓間充質干細胞的分離后鏡下的形態見圖1。

圖1 MSCs呈漩渦狀生長融合 ×40

2.2 尾靜脈組在不同時間點的大鼠頭 MRI成像的比較 可以看到造MCAO模型后尾靜脈移植干細胞后 1d左側大腦半球大面積的高信號影即梗死灶(見圖2),3m后再次復查 MRI時沒有高信號影(見圖3),大鼠運動功能恢復正常。

圖2 尾靜脈組 1d的 MRI

圖3 尾靜脈組 3m的 MRI

表1 不同時間點兩組大鼠神經功能評分的影響±s)

表1 不同時間點兩組大鼠神經功能評分的影響±s)

與對照組比較*P＜0.05

尾靜脈組對照組P值14.40±0.547714.50±0.54770.4519.50±0.5477*12.33±0.51640.0397.60±0.5345*10.50±0.54770.0165.60±0.5477*8.00±0.63250.0253.60±0.5477*5.50±0.54720.020

2.3 神經功能缺損評分 見表1。

2.4 HE染色結果 對照組可見到明顯梗死灶,缺血區神經細胞明顯減少,可見神經細胞變性、壞死,呈胞體皺縮,核固縮、碎裂、溶解,胞漿濃縮紅染,神經纖維疏松,間質水腫明顯,炎癥細胞浸潤。移植細胞組病理變化較對照兩組輕,神經細胞變性、壞死數量明顯變少,間質水腫較輕(見圖4、圖5)。

圖4 對照組的 HE染色(×100)

圖5 移植組的 HE染色(×100)

2.5 免疫組化結果 (1)BrdU單染結果:對照組未見到 Brdu免疫組化陽性的細胞著色,尾靜脈組可見到 Brdu陽性細胞,細胞呈圓形,細胞核是紅色的,尾靜脈組 BrdU陽性細胞在脈絡叢、腦室管膜周圍、血管周圍分布較多,尾靜脈組的肝組織中也見到少量 Brdu染色陽性的細胞(見圖6、圖7)。(2)免疫雙染結果:尾靜脈組在移植后 1m后的免疫組化染色時均有 MSCs分化的雙陽性細胞,即 Brdu+NSE、Brdu+GFAP,其中 NSE陽性細胞說明分化為神經元,GFAP陽性說明分化為神經膠質細胞,表現為細胞核紅色,胞漿為藍色(見圖8、圖9)。(3)BDNF檢測結果:細胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細胞(見圖10、圖11)。單染結果用陽性細胞數表示(見表2)。

表2 MSCs對大鼠腦缺血再灌注后 BDNF表達的影響±s)

表2 MSCs對大鼠腦缺血再灌注后 BDNF表達的影響±s)

與對照組比★P＜0.05

尾靜脈組對照組P值6631.45±0.5112★20.53±0.47760.00322.61±0.6553★16.74±0.37560.01116.80±0.8366★11.50±0.54770.005

圖6 尾靜脈組腦內Brdu單染細胞(×100)

圖7 尾靜脈組肝內Brdu單染細胞(×100)

圖8 Brdu+NSE免疫雙染細胞(×400)

圖9 Brdu+GFAP免疫雙染細胞(×400)

圖10 BDNF單染胞漿陽性(×400)

圖11 BDNF單染白質纖維束陽性(×200)

3 討 論

骨髓是造血器官,干細胞最初的概念也是源于骨髓,骨髓中除了有造血干細胞外,作為間充質細胞成分之一的間充質干細胞的含量估計只占全骨髓細胞的 1/105[1],因此研究它的體外培養、擴增及純化具有重要的意義?，F在各實驗室主要是用 3種方法來分離 MSC,即梯度離心法[2]、貼壁培養法、免疫吸附法[3]。本實驗中我們結合了密度梯度離心法和貼壁法分離骨髓中的 MSCs,這樣培養的細胞貼壁快,呈集落樣生長,細胞呈均勻一致的紡錘形。通過換液以棄除仍懸浮生長的血細胞、巨噬細胞等雜細胞,使其得以純化,最初分離的細胞是混雜的細胞群,且為多態的,經過 2～3次傳代后 MSCs的形態就趨于一致,分離培養的 MSCs在顯微鏡下觀察,90%以上為梭形或呈紡錘形的細胞,形成漩渦狀,部分為大的扁平形細胞,即為較高純度的 MSCs。本實驗病理學觀察發現,光鏡下 HE染色可見對照組梗死灶明顯,缺血區神經細胞明顯減少,可見大量神經細胞變性、壞死,呈胞體皺縮、核固縮、碎裂、溶解,間質水腫明顯,大量炎癥細胞浸潤。尾靜脈移植組神經細胞變性、壞死數量明顯變少,炎癥細胞減少,間質水腫減輕。說明 MScs治療缺血性腦損傷是切實有效的。

當前 MSCs移植的途徑主要有 3種:立體定向、動脈途徑、靜脈途徑。其中立體定位途徑對受體的腦組織有一定的損傷,動脈途徑移植難度較大,靜脈途徑注射侵襲性小,操作方便、安全。Brazelton[4]研究小組將表達綠色熒光蛋白(GFP)成鼠的 MSCs經尾靜脈注入經致死量照射的同基因成鼠體內,發現在嗅球、海馬、皮層、小腦有 GFP細胞。因此我課題組設計了尾靜脈途徑移植 MSCs,觀察 MSCs在體內的存活及分化情況,以及神經功能缺損的恢復和神經營養因子(BDNF)的分泌情況并探討相關的機制。目前國內外研究 MSCs還可促進缺血區新血管再生[5],Liu等[6]實驗表明用胎盤生長因子(Placental growth factor,PLGF)基因修飾的人 MSCs能誘導腦梗死大鼠腦內的血管發生,促進其損傷功能的恢復。移植的 MSCs還可促進內源性細胞增殖,Crigler等[7]的實驗表明人 MSCs移植后,其不同的細胞亞型表達不同的神經細胞調控分子(軸突誘導因子、軸突導向及神經細胞粘附分子),對宿主神經細胞的存活和神經再生起到了一定的作用。此外還可以分化為神經細胞和膠質細胞發揮替代作用[8]。本實驗觀察到,移植后 1d時在由于是卒中急性期,興奮性神經遞質、自由基以及炎性因子可能會威脅進入缺血區的新細胞,移植的細胞難以發揮作用及分化,因此兩組的 NSS評分間無統計學差異。2w、1m、2m、3m時尾靜脈組 NSS評分明顯低于對照組,在移植后 1m時免疫組化染色即可以見到免疫雙陽細胞,可能是MSCs進入到缺血損傷部位,促進內源性靜態的神經干細胞被激活以及更容易促進體內的細胞因子和神經生長因子的分泌,修復破壞的神經環路,分化后發揮神經替代修復作用。關于尾靜脈注射時 MSCs如何通過血腦屏障,可能有幾種機制:(1)腦損傷后血腦屏障的破壞,可能有助于 MSCs選擇性進入缺血腦區。(2)與受損傷的腦組織釋放一些趨化因子有關[9]。(3)缺血后細胞間黏附分子的表達增高并相互作用。(4)腦缺血可以誘導缺血周邊區神經營養因子的表達,如腦源性神經營養因子(BDNF)、膠質細胞源性營養因子(GDNF)[10]、胰島素樣生長因子(IGF-1)[11]等,這些營養因子可能對 MSCs的存活、遷移和分化起重要作用。

本實驗觀察腦缺血性損傷后在不同的時間點移植組的 BDNF陽性細胞數明顯高于對照組,說明了MSCs移植后能顯著增加腦內 BDNF的合成,促進缺血性腦損傷的恢復。這也是尾靜脈移植治療腦缺血損傷的重要機制。BDNF屬于神經營養素家族之一,相對分子量為 12.3ku的堿性蛋白。它不僅在中樞神經系統發育過程中對神經元的生存、分化、生長和維持神經元正常的生理功能起關鍵作用,而且還具有抗傷害刺激、促使神經元損傷后的再生。Arai等[12]在一側大腦中動脈阻塞(MCAO)動物模型上發現,在梗死灶周圍的皮質及雙側的海馬 BDNF及其受體 TrkBmRNA表達明顯增加。BDNF減輕腦缺血神經損害的機制有以下幾點:(1)拮抗興奮性氨基酸毒性。(2)穩定細胞內 Ca2+濃度。(3)減輕自由基損傷。(4)抑制神經細胞的凋亡。BDNF可通過調節 Bcl-2、Bax蛋白的表達而抑制細胞的凋亡[13]。

總之,大腦中動脈閉塞(MCAO)的大鼠早期通過尾靜脈移植 MSCs,可在大鼠腦組織中存活并部分分化為神經細胞,顯著加速大鼠的神經功能的恢復,還可以促進神經營養因子 BDNF的分泌增加,為缺血性腦梗死的治療開辟了新的道路,在未來的臨床應用中還有許多問題有待于解決,如移植的安全性問題等。

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