不同類型發花磚茶特征香氣成分研究

金友蘭，黃甜，蔣容港, 黃芳芳, 劉仲華,3, 黃建安, 李勤,3*

1(茶學教育部重點實驗室(湖南農業大學)，湖南 長沙, 410128) 2(國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙,410128) 3(湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙, 410128) 4(益陽茶廠有限公司，湖南 益陽, 413046)

“發花”是茯磚茶加工過程中重要的加工工藝。優勢菌種冠突散囊菌在適宜溫濕度條件下快速繁殖，茶葉內含成分在濕熱作用和微生物胞外酶作用下發生復雜的變化，從而形成了茯磚茶特有的品質特征[1-2]。研究表明，茯磚茶特有的風味品質與保健功效的形成與“發花”工序密切相關[3-4]。

茶葉中的揮發性物質是決定茶葉品質與風味的重要因子之一。迄今為止，從茶葉中分離鑒定出的芳香物質已有數百種。近年來，隨著茯磚茶的逐漸興起及其獨特的保健功效[5-9]，越來越多的廠家通過對不同類型的毛茶原料進行“發花”處理，開發了多種新型發花磚茶產品，而發花紅茶磚和發花白茶磚是其中2種主要的類型。但是，由于目前關于發花白茶磚和發花紅茶磚品質特征研究較少，其特征香氣成分尚不明確，阻礙了其生產工藝的發展和產品的標準化。

本研究以茯磚茶、發花白茶磚和發花紅茶磚為研究對象，采用感官審評、頂空固相微萃取、氣相色譜-質譜聯用、香氣活性值(odor activity value,OAV)值法結合化學計量學，研究不同類型發花磚茶特征香氣成分，以期為發花磚茶工藝、產品創新和標準化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

以白茶、紅茶和黑毛茶為原料發花的發花白茶磚、發花紅茶磚和茯磚茶,購于市場。

1.1.2 主要儀器和試劑

Agilent 7890A-5975C氣質聯用儀、HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,美國Agilent公司；50/30 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂層纖維(DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國Supelco公司；磁力加熱攪拌器,北京康林科技有限責任公司；電子天平。

NaCl,國藥集團化學試劑有限公司；乙醇(色譜純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；癸酸乙酯,美國Sigma試劑公司。正構烷烴混標(C8-C40)，上海Sigma-Aldrich公司。

內標溶液配制：取癸酸乙酯標準品母液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成質量濃度為0.864 g/L的標準液，然后稀釋到8.64 mg/L，分裝,放置4 ℃下備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官審評方法

感官審評按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[10]，對發花磚茶外形和內質進行描述和打分。

1.2.2 香氣分析方法

稱取1.0 g磨碎的茶樣與0.5 g NaCl加入到20 mL頂空萃取瓶中，加入5 mL沸騰蒸餾水以及10 μL癸酸乙酯內標溶液，封口，80 ℃、400 r/min磁力攪拌器平衡10 min后插入裝有50/30 μm萃取頭的手動進樣手柄，吸附萃取40 min后，收回萃取頭纖維部分再取出萃取頭，并盡快插入GC-MS進樣口中，250 ℃解析5 min。

GC條件：Agilent HP-5MS色譜柱,石英毛細管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，然后以15 ℃/min升至280 ℃，保持1 min，以280 ℃運行3 min，溶劑延遲時間為3 min。載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，載氣流速1 mL/min；進樣模式不分流。

MS條件：離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，進樣口溫度250 ℃，EI源能量70 eV，電子倍增電壓;880 V，采用全掃描模式,掃描范圍35～400 u。

定性方法：由GC-MS分析得到各色譜峰的質譜信息與NIST 17標準譜庫進行檢索比對，匹配指數大于80%作為物質鑒定標準；通過 C7-C40 正構烷烴混標物的保留時間，計算未知化合物的保留指數(retention index,RI)，結合文獻以及數據庫中的RI對化合物進行鑒定，RI按公式(1)計算:

RI=100n+100×[(RTx-RTn)/(RTn+1-RTn)]

(1)

式中：RTx,待測物質的保留時間;RTn,n個碳原子數正構烷烴的保留時間;RTn+1,n+1個碳原子數正構烷烴的保留時間[11]。

定量方法[12]：通過計算待測揮發物與癸酸乙酯的峰面積之比求得其含量(假定各揮發物的絕對校正因子為1.0)，按公式(2)計算：

(2)

式中:比值,峰面積比值;m,茶樣質量,1 g。

每個樣品獨立重復檢測3次。

1.2.3 OAV計算

在各種揮發性成分定量的基礎上，根據參考文獻中各揮發性物質在水中的風味閾值，按公式(3)計算各成分的OAV[13]：

(3)

式中：ωi,茶葉組分i的含量,ng/g；OTi,組分i在水中的香氣閾值,μg/kg。OAV≥1的化合物被確定為茶葉中的活性香氣化合物。

1.3 數據分析

采用Agilent MassHunter 7.0 進行定量分析，數據結果表示為平均值±標準偏差，采用SIMCA-P進行主成分分析(principal component analysis, PCA)、聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)以及正交偏最小二乘判別分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)分析，R軟件對差異揮發性成分進行熱圖(Heatmap)分析。

2 結果與分析

2.1 不同類型發花磚茶特征香氣感官品質分析

感官審評表明(表1)，不同原料加工而成的發花磚茶在外形、色澤和金花形態上差異不明顯，但香氣感官品質差異明顯。以黑毛茶為原料加工而成的茯磚茶香氣感官特征呈現菌花香帶木香，并略帶泥土氣；以白茶為原料加工而成的發花白茶磚香氣感官特征呈現菌花香，且帶清香；以紅茶為原料加工而成的發花紅茶磚香氣感官特征呈現菌花香，并帶紅茶獨特的花香、甜香。新型發花磚茶均具有典型的“菌花香”，但也具有各自獨特的香氣特征。

表1 發花磚茶樣品信息及感官審評結果Table 1 The sample information and sensory evaluation results of fungal fermentation brick teas

2.2 不同類型發花磚茶揮發性成分分析

不同類型發花磚茶共鑒定出75種揮發性成分(表2)，包括醛類16種、醇類12種、酮類20種、酯類7種、內酯類3種、碳氫類化合物12種、雜氧類化合物4種以及酚類化合物1種。其中，醛類、醇類和酮類化合物是3種發花磚茶的主要揮發性成分，且含量均為茯磚茶>發花紅茶磚>發花白茶磚，同樣，雜氧類化合物在茯磚茶中的含量也顯著高于其他兩類發花磚茶，而酯類、碳氫類和酚類化合物在發花紅茶磚中的相對含量高于茯磚茶和發花白茶磚。

茯磚茶中含量高的揮發性成分主要有(E,E)-2,4-庚二烯醛(2 587.88±207.56) ng/g、氧化芳樟醇I(1 856.99±143.09) ng/g、2-正戊基呋喃(1 645.81±72.57) ng/g、3,5-辛二烯-2-酮(769.96±68.28) ng/g、β-紫羅蘭酮(553.56±9.06) ng/g、E-2-辛烯醛(426.15±23.10) ng/g、己醛(407.09±21.279) ng/g、甲基庚烯酮(335.83±18.74) ng/g和壬醛(326.46±25.52) ng/g。發花白茶磚中含量較高的揮發性成分主要有苯甲醛(306.00±7.361) ng/g、苯乙醇(249.99±11.20) ng/g、氧化芳樟醇II(212.88±14.36) ng/g、芳樟醇(205.64±15.42) ng/g和水楊酸甲酯(361.58±29.10) ng/g。發花紅茶磚中含量較高的揮發性成分主要有水楊酸甲酯(916.53±45.86) ng/g、(E,E)-2,4-庚二烯醛(702.35±50.27) ng/g、氧化芳樟醇I(522.24±22.58) ng/g、β-紫羅蘭酮(350.55±28.14) ng/g、芳樟醇(319.18±14.69) ng/g和氧化芳樟醇II(306.20±24.72) ng/g。

續表2

2.3 不同類型發花磚茶香氣成分分析

香氣化合物單體在整體香氣中的貢獻主要取決于閾值及其含量，可以通過計算OAV進行表征。以往研究認為OAV>1的揮發性成分對樣品香氣形成有貢獻，OAV>10的揮發性成分被認為是重要的香氣成分[14-15]，根據文獻報道的揮發性成分的閾值和屬性描述，計算各個揮發性成分的OAV。結果表明(表3)，共有37種揮發性成分可計算OAV。

表3 揮發性成分OAV值和香氣描述Table 3 OAV value and aroma description of volatile compounds

茯磚茶中呈香物質有25種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有14種，包括青氣屬性的己醛、庚醛、壬醛、(E,E)-2,4-庚烯醛、(E,E)-2,4-壬烯醛、3,5-辛二烯-2-酮和2-正戊基呋喃；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；果香屬性的β-環檸檬醛和檸檬醛；花香屬性的芳樟醇和α-紫羅酮;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-正戊基呋喃的OAV最高，分別達到(1 539.93±136.57)、(1 151.30±92.58)和(342.87±15.11)。

發花白茶磚中呈香物質有22種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有10種，包括青氣屬性的己醛、3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬烯醛和2-正戊基呋喃；果香屬性的β-環檸檬醛；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；花香屬性的芳樟醇和α-紫羅酮;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛的OAV最高，分別達到(231.49±17.18)和(145.28±16.07)。

發花紅茶磚中呈香物質有27種(OAV>1)，其中，OAV>10的重要香氣成分有12種，包括青氣屬性的己醛、(E,E)-2,4-庚烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬烯醛和2-正戊基呋喃；果香屬性的β-環檸檬醛；蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇；花香屬性的芳樟醇、α-紫羅酮和水楊酸甲酯;甜木香屬性的雪松醇和木香屬性的β-紫羅蘭酮。其中青氣屬性的3,5-辛二烯-2-酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛和甜木香屬性的雪松醇的OAV最高，分別達到(457.38±24.01)、(343.54±8.00)和(292.01±23.44)。

2.4 不同類型發花磚茶特征香氣成分分析

采用PCA、HCA、OPLS-DA結合OAV，研究茯磚茶、發花白茶磚和發花紅茶磚中特征香氣成分。PCA和HCA(擬合參數為R2X=0.955，Q2=0.915)分析表明(圖1)，茯磚茶、發花白茶磚和發花紅茶磚可明顯分為3組，表明茯磚茶、發花白茶磚和發花紅茶磚揮發性成分組成存在顯著差異。

a-PCA得分圖;b-HCA圖圖1 不同類型發花磚茶揮發性成分比較分析Fig.1 Comparative analysis of volatile components of different types of fungal fermentation brick tea

基于PCA和HCA結果，構建了3個OPLS-DA模型(茯磚茶 VS 發花白茶磚；茯磚茶 VS 發花紅茶磚；發花白茶磚 VS 發花紅茶磚)，置換檢驗(permutation test)R2=0.842、Q2=-0.207,R2=0.614、Q2=-0.722和R2=0.389、Q2=-0.771，判別模型有較好的解釋能力，且不存在過擬合現象。共篩選出24種差異揮發性成分(VIP>1)如表4所示。

結合OAV值(OAV>1)，共篩選出15種特征香氣成分，包括(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛、壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、苯乙醛、氧化芳樟醇I、芳樟醇、雪松醇、1-辛烯-3-醇、樟醇、3,5-辛二烯-2-酮、β-紫羅蘭酮、甲基庚烯酮、水楊酸甲酯和2-正戊基呋喃。

如圖2所示，茯磚茶中具有青氣屬性的(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、己醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮、2-正戊基呋喃和甲基庚烯酮以及木香屬性的氧化芳樟醇I和β-紫羅蘭酮的含量顯著高于其在發花白茶磚和發花紅茶磚中的含量，為茯磚茶的特征香氣成分。

表4 基于OPLS-DA篩選不同類型發花磚茶差異揮發性成分Table 4 Screening of different volatile components of different types of Fungal fermentation brick tea based on OPLS-DA

M1-己醛;M2-壬醛;M3-苯乙醛;M4-(E，E)-2,4-庚二烯醛;M5-(E，E)-2,4-壬二烯醛;M6-氧化芳樟醇I;M7-芳樟醇;M8-雪松醇;M9-1-辛烯-3-醇;M10-樟醇;M11-3,5-辛二烯-2-酮;M12-甲基庚烯酮;M13-β-紫羅蘭酮， M14-水楊酸甲酯;M15-2-正戊基呋喃圖2 不同類型發花磚茶關鍵特征香氣成分Heatmap分析Fig.2 Heatmap analysis of differential volatility components of different types of fungal fermentation brick tea

發花白茶磚中具有清香屬性的苯乙醛的含量顯著高于其在茯磚茶和發花紅茶磚中的含量，為發花白茶磚的特征香氣成分。發花紅茶磚中具有蘑菇香、泥土氣屬性的1-辛烯-3-醇、具有花香屬性的芳樟醇、樟醇和水楊酸甲酯以及具有甜木香屬性的雪松醇的含量顯著高于其在茯磚茶和發花白茶磚中的含量，為發花紅茶磚的特征香氣成分。

3 討論與結論

揮發性成分的組成與含量形成了茶葉的香氣特征，并受茶樹品種、原料及加工工藝的影響[18]。本研究以不同茶類原料經“發花”工藝制成的發花磚茶為研究對象，對其香氣感官屬性、揮發性成分和香氣成分組成進行分析，結果表明3種發花磚茶在特征香氣成分的種類及含量上具有顯著差異。

基于OAV分析法，鑒定了27種呈香揮發性成分，主要以青氣屬性、花香屬性和木香屬性物質為主。其中，青氣屬性的物質在3種發花磚茶中均占主導地位，特別是3,5-辛二烯-2-酮和(E,E)-2,4-壬二烯醛，在3種發花磚茶中OAV均達最高，這可能導致3種發花磚茶均具有典型的“菌花香”，表明這2種香氣成分在發花磚茶共有的典型“菌花香”形成中起重要作用。

采用化學計量學方法篩選出3種發花磚茶中15種特征香氣成分。其中茯磚茶中的(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛、壬醛、3,5-辛二烯-2-酮、甲基庚烯酮、2-正戊基呋喃、氧化芳樟醇I和β-紫羅蘭酮含量顯著高于發花白茶磚、發花紅茶磚，貢獻了茯磚茶的特有“木香”和“泥土氣味”，與先前研究[19-20]茯磚茶香氣成分結果一致，且均是茯磚茶中主要揮發性成分[21-22]，其中，氧化芳樟醇I的形成與茯磚茶、普洱茶發酵過程中真菌生長密切相關[23-24]。發花白茶磚具有“菌花香帶清香”的香氣感官品質，其中具有清香屬性的苯乙醛含量顯著高于茯磚茶、發花紅茶磚。苯乙醛是由苯丙氨酸經脫羧后形成的相應醛類物質，使茶葉呈現淡淡的花香，稀釋后具有清香[25],有研究認為苯乙醛是白茶香氣的主要組成成分[26-27]，主要貢獻發花白茶磚中的清香[24-25]，劉菲等[28]的研究結果也證實了這一點。發花紅茶磚中1-辛烯-3-醇、雪松醇、芳樟醇、樟醇和水楊酸甲酯的含量顯著高于茯磚茶、發花白茶磚，其香氣描述為蘑菇香、甜木香和花香。這些香氣屬性描述詞均可用以描述“菌花香”感官屬性[29]，也是紅茶香氣中最主要的物質[30-31]。

同時，本研究也發現茯磚茶和發花紅茶磚在香氣成分組成上更為接近，蔡正安等[32]采用冠突散囊菌接種不同茶類的原料進行“發花”處理。結果表明，相比于接種在未發酵原料茶(白茶、綠茶)上的生長情況，冠突散囊菌在發酵茶(紅茶、黑茶、青茶)中生長情況更好，推測可能與茯磚茶和發花紅茶磚原料均經過發酵處理有關，而發花白茶磚揮發性成分含量整體偏低可能與白茶原料未經發酵有很大關系[32]。

此外，已鑒定的揮發性物質中有部分化合物由于閾值缺乏，無法利用OAV法衡量其對不同類型發花磚茶特征香氣的貢獻，而且OAV方法對樣品中的特征風味化合物的分析也存在一定局限性，后續還將采用不同方法對發花磚茶的特征香氣成分開展進一步驗證研究。