微生物發酵法制備活性多糖的研究概述

劉袆帆,林諾怡,成堅,馬路凱,陳乃驛,馮浩鍇,王琴

(仲愷農業工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州,510225)

多糖作為一種結構復雜的高分子化合物,主要由醛糖和酮糖通過糖苷鍵組成,是通過2種或以上單糖按一定比例組成的聚合物,其支鏈連接形式復雜多樣。多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血糖及免疫調節等多種生物活性,已成為食品科學、生命科學及醫藥領域的關注熱點。目前,多糖提取的方法主要包括溶劑提取法、酶提取法和超聲波提取法等[1],主要原理是基于多糖不溶于乙醇,易溶于水的物理性質,但提取多糖后剩余的物質將無法被利用而丟棄,造成原材料的浪費。

微生物發酵法是生物轉化法的一種,是指利用完整的微生物細胞作為生物催化劑,與酶轉化法相比而言,使微生物發酵產酶過程與酶作用過程合二為一,其本質是外源化合物被生物體系中所含有的酶催化,該催化反應類型復雜,幾乎囊括所有的體外有機化學反應,它不同于簡單的生物降解或生物合成,從而縮短了整個生產周期,降低了生產成本,提高活性多糖的生產效率[2]。原材料中的碳源、氮源、無機鹽等能被微生物的生長所利用,但微生物不能直接利用多糖,從而能達到對多糖的純化分離及富集的目的[3-4]。本文圍繞微生物法制備發酵多糖,總結了國內外的相關研究成果,從多糖發酵菌種、發酵工藝、合成途徑及結構、活性4個方面闡述微生物發酵法制備多糖的研究進展,希望能促進其在各個領域的研究運用。

1 發酵菌株

活性多糖的發酵菌株一般為食用真菌[5-6]、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、鏈霉菌[7-8]、克勞氏芽胞桿菌、納豆芽孢桿菌[8]、非解乳糖鏈球菌[9]、乳酸菌[10-11]、曲霉、內生真菌等,見表1。對高產菌株進行選育并實現多糖大規模生產是微生物發酵法制備多糖的第一步,也是多糖的開發與廣泛應用的重要難題。

目前,從動物、植物和海洋藻類中提取的多糖占主導地位,但也有許多微生物(如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、古細菌、真菌以及一些微小藻類)能產生胞外多糖。已大量投入生產的微生物胞外多糖主要是由白串珠菌、假單胞菌、黃單胞菌等合成的黃原膠、葡聚糖、熱凝多糖和結冷膠等,作為生物絮凝劑、生物吸附劑、給藥劑等廣泛應用于食品、醫藥、化工等行業。由于許多“藥食同源”的真菌含有抗腫瘤、抗菌、降血脂、降血壓、免疫激活、保肝、防血栓等多種功能,利用真菌產活性多糖成為研究熱點,如盛悅[12]對猴頭菌 He-02 進行液體發酵得到胞外多糖，其產量為 29.37 mg/mL。裴智鵬等[13]采用10種不同的靈芝菌株發酵得到靈芝多糖,在培養至第7天時,G0023和G0160菌株胞外粗多糖含量分別為3.02和3.14 g/L,多糖得率分別達到了84.11%和91.03%,可作為發酵高產胞外多糖的優良菌株。

菌種發酵的目的除了可以提高多糖產量外,還可以起到增強活性的作用。王丹等[14]分別比較了面包酵母、釀酒酵母、紅曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌在發酵過程中多糖含量和多糖活性的變化,結果發現,發酵后的鐵皮石斛多糖對自由基的清除能力和體外降血糖能力明顯提高,紅曲霉和面包酵母可以明顯提高鐵皮石斛對自由基的清除和體外降血糖能力,說明發酵可以作為增強鐵皮石斛功能和開發鐵皮石斛保健品的重要手段之一。張倩茹[15]采用植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌發酵玉米芯,結果發現未發酵和發酵玉米芯粗多糖對DPPH自由基、羥基自由基的清除率以及還原力都隨濃度的提高而升高,且發酵玉米芯粗多糖的抗氧化能力顯著高于未發酵玉米芯粗多糖。利用微生物培養法生產活性多糖具有廣泛的應用前景,同時也可以大幅度減少環境污染。因此,微生物發酵菌種問題的解決將會給活性多糖的實際生產帶來巨大的商業價值和社會效益。

表1 多糖發酵菌株與發酵工藝參數Table 1 Fermented polysaccharides and fermentation strains

2 多糖發酵工藝

2.1 培養基及培養條件的優化

為提高多糖產出率,可從培養基組成和培養條件兩方面分別進行優化。從培養基的配方優化而言,微生物生長所需的多種碳源、氮源均會對其生長造成不同的影響,從而導致最終的多糖產量出現偏差,而培養條件如溫度、pH和時間,則很大程度上決定了微生物的生長質量[25]。為了使發酵效率達到最大化,優化得出最佳的碳源、氮源及無機鹽濃度等影響因素,將多糖產量和生物量作為指標,對培養基進行實驗優化,如對于出芽短梗霉,采用多種不同碳源進行培養,得出蔗糖為發酵普魯蘭多糖的最佳碳源[26],因在蔗糖作為唯一碳源的情況下,合成普魯蘭多糖的轉化率最為高效,已普遍得到學者們的認同。LIN等[27]發現通過調整培養基組成和培養條件,能夠大幅度提升菌絲體和多糖產量,且發現能夠使用深層發酵方法生產姬松茸菌絲體、并能提高多糖發酵效率。蘭蓉等[28]利用正交實驗,篩選出白靈菇液體發酵的最佳培養基組成：葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%；白靈菇液體發酵產胞外多糖的最佳發酵條件為：起始pH值7.0,接種量20%,裝液量120 mL,培養6 d。郭霞等[29]對藥用真菌桑黃培養基進行了優化,最終確定了優化培養基(g/L):蔗糖50、玉米漿3.0、KH2PO410.0、MgSO41.0、CaCl23.0、VB12.0×10-4,且在此情況下,胞外多糖合成速度更快,相比于搖瓶法,生產最大值和生產強度分別提高了26.5%和50%。

2.2 發酵參數與模式的優化

目前,對于微生物發酵制備多糖方法的研究仍然處于起步階段,當前最主流的發酵方法有3種：固態發酵法、深層液態發酵法和雙向發酵法。

液態發酵法的發酵原理是將菌體接種到液體培養基中,根據其最佳的發酵條件進行培養,后將菌體產生的多糖在液體培養基的成分中進行分離純化操作,從而獲得目標產物。由于液體介質的特性,生長的菌種具有生產周期短和菌齡平均的優點,更有利于生產效率的提高與產物質量的規范。趙俊杰等[17]對香菇進行液態發酵實驗,在短時間內獲得大量的香菇多糖產物,并在最大程度上提高了香菇B08的生產效率。與傳統法相比,液態發酵法具有生產周期短,不受季節、環境和地區的限制,短時間內可得大量目標產物等優勢,但也存在易受污染、產品純度低及多糖提取率低等缺陷。

固態發酵法的發酵原理是將菌體先接種在液態培養基中培養一段時間,達到快速增加菌種數量,后轉移至固態培養基中進行后續培養,此方法產出的多糖主要集中于菌絲體和固態培養基中,便于進行產物分離操作。固態發酵法具有成本低廉,發酵過程不容易造成污染的優點,但產量低、發酵周期過長。因此,如何提高多糖產量和縮短發酵時間,成為了優化固態發酵法的關鍵。董玉瑋等[30]以低品質牛蒡作為營養基質,優良靈芝菌種作為發酵菌株,發酵后多糖含量為24.85 mg/g。辛燕花等[31]以靈芝菌株作為出發菌株,以銀杏葉作為基質,通過雙向發酵工程技術,優化得到靈芝-銀杏雙向固態發酵的最佳條件。

微生物發酵法有其獨特的優勢,能夠以低廉的成本、大幅度提高產率、生產周期短、不受季節影響和生產工藝簡單等優點,而對于多糖的發酵生產,生產成本及產多糖的效率是應考慮的兩大因素。

3 細菌多糖的生物合成途徑

目前的研究方向大多集中于細菌多糖的合成途徑,特別是對于乳酸菌多糖的生物合成,而對于真菌多糖的合成途徑的研究尚處起步階段。雖然合成的多糖具有不同的單糖種類及數量,但細菌多糖主要的合成途徑卻很相似,主要為以下4個步驟：前體核苷酸糖(單糖的活化形式)的合成；合成的起始反應；重復單元的延伸、翻轉和聚合及多糖的輸出[32],即是將單糖通過糖基轉移酶從核苷酸糖轉移,并連接到脂類載體形成重復單元,隨后是重復單元的聚合和輸出,形成細胞表面多糖,是多種酶和轉運系統的結果,發生的部位包括胞內和胞外,有些合成過程會發生在細胞壁上。

3.1 前體核苷酸糖的合成

多糖主要分成兩種不同的類型：同型多糖和異型多糖,不同類型多糖的前體糖苷酸合成途徑也各不相同。異型多糖的核苷酸合成途徑更復雜多樣,雖然合成的多糖具有不同的單糖種類及數量,但其生物合成途徑卻有著相似的步驟,如圖1所示。以葡萄糖作為主要碳源,通過轉移酶進入細胞后,通過葡萄糖激酶轉化葡萄糖-6-磷酸這一基本代謝途徑,之后經過3個途徑：1)通過α-磷酸葡糖變位酶轉化為葡萄糖-1-磷酸,此途徑為多糖生物合成的必經途徑,后合成TDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸；2)葡萄糖-6-磷酸轉化為GDP-甘露糖和GDP-巖藻糖；3)通過酶促反應,將6-磷酸葡萄糖轉變為果糖-6-磷酸,然后產生UDP-n-乙酰基半乳糖胺和GDP-果糖,同時果糖-6-磷酸還能夠進入糖酵解途徑產生丙酮酸,并通過厭氧途徑將其轉化為乳酸,或通過需氧途徑進入檸檬酸循環以產生ATP和其他產物,這些ATP為多糖合成提供能量保障[33]。以果糖作為發酵碳源,進入細胞后轉化為果糖-6-磷酸,后轉化為丙酮酸進入三羥酸代謝循環。而以乳糖作為碳源,經β-半乳糖苷酶等轉化為葡萄糖-6-磷酸,后進入核苷酸糖的合成。各個途徑中涉及的碳源和轉換結構不同,合成過程中用到的關鍵酶也有所不同,但其合成過程均包含α-葡萄糖基磷酸變位酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶,UDP-半乳糖4-表異構酶和葡萄糖磷酸異構酶[34]。

1-葡萄糖激酶;2-α-磷酸葡糖變位酶;3-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶;4-鼠李糖合成酶系;5-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶;6-UDP-半乳糖-4-差向異構酶;7-NAD連接的脫氫酶;8-磷酸甘露糖變位酶 9-GDP-甘露糖焦磷酸化酶;10-脫水酶和GDP-巖藻糖合成酶:11-磷酸葡糖異構酶;12-β-半乳糖苷酶;13-半乳糖苷變旋酶;14-半乳糖激酶;15-半乳糖-1-磷酸轉移酶；16-UDP-木糖-4-差向異構酶；17-轉移酶；18-聚合酶圖1 多糖核苷酸前體的合成Fig.1 Synthetic pathway of polysaccharides

因此,對磷酸葡糖變位酶和葡萄糖焦磷酸化酶進行基因克隆,提高關鍵酶的表達量來使得生物代謝途徑偏向多糖的生物合成,以此來提高多糖生物合成量[35]。

3.2 合成的起始反應

多糖的合成階段主要受調控基因、鏈長決定基因、重復單元合成基因、聚合及輸出基因等胞外多糖生物合成基因簇所控制。通過糖基轉移酶,將核苷酸糖轉移到脂載體上,在細胞質膜的內表面啟動重復單元的合成[33]。不同的糖基轉移酶類型及數量決定重復單元的組成及大小,目前只能通過基因簇判斷有哪些核苷酸糖前體組成,還無法推測出排列順序以及基因調控重復單元組裝的具體過程。

3.3 重復單元的延伸、翻轉和聚合

在細胞膜和細胞壁上的酶作用下,組裝好的重復單元最終被運送到指定的位點形成粘液或者包裹在細胞周圍。重復單元翻轉和聚合有3種不同的機制：Wzy-dependent 途徑、ABC-transporter dependent 途徑和 synthase-dependent 途徑。多數異型多糖是通過Wzy-dependent 途徑合成的,需要鏈長決定基因及Wzx、Wzy 和 Wzz蛋白參與運輸及組裝,糖重復單元在Wzx酶的作用下從細胞膜的胞質側翻轉到周質空間,并在OPX家族的周質蛋白、PCP周質蛋白、聚合酶Wzy 和 Wzz作用合成多糖鏈。ABC-transporter dependent 途徑較特殊,一般存在于E.coliO8、O9、O52 等的 O-抗原及莢膜多糖群的合成中。synthase-dependent 途徑最為罕見,是通過β-Barrel通道蛋白等將糖鏈運輸至指定位點,目前只在Salmonellaenterica質粒編碼的O54 抗原的合成中觀察到[36]。

3.4 多糖的輸出

重復單元完成聚合、延伸后,需將重復單元聚合并分泌到胞外,李歐[33]發現PaenibacilluselgiiB69胞外多糖的相關ORFs包括：包括pelE、pelF、pelG、pelH、pelL和pelM基因,其中pelH和pelM都與O-抗原轉運蛋白具有相似性,Pel基因簇中的pelG及pelL與Wzy具有一定的相似性,可能作為聚合酶參與多糖的合成。關于多糖的輸出研究較少,其主要的研究都集中在E.coli,3種途徑的糖鏈組裝及翻轉方式是相同的。

4 多糖結構及活性

4.1 發酵法制備多糖的結構改變研究

多糖的結構極其復雜,從一級結構到四級結構不等。因高級的空間結構過于復雜,目前大量研究是基于多糖的化學結構中最基礎的一級、二級結構上[37]。多糖的結構,主要研究的是單糖組成、糖苷鍵類型、糖殘基連接順序、位點、糖環類型、分子質量以及羥基取代情況等。近年的研究表明,利用發酵可以改變多糖的結構特征,由于物質的性質決定于其結構,進而提出通過發酵法來改變多糖功能活性,提高多糖利用度的方法。在馮炘等[38]的研究中,設立對照組多糖和發酵組多糖,通過電鏡分析和紅外分析其結構表明,雖然2組多糖均主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖構成,但其摩爾比發生了改變,由1∶4.6∶6.5∶1.4∶2.9∶2.5變為1∶13.4∶16.8∶3∶2.7∶8.4,其中,木糖與葡萄糖的比例有顯著上升。高鶴[39]研究發現,用植物乳桿菌NCU116發酵的苦瓜多糖,其多糖的蛋白質含量、分子質量甚至單糖組成均發生了改變。

4.2 發酵多糖的活性研究

發酵功能性多糖普遍具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌和增強免疫等功效。研究表明,微生物發酵可以改變一些多糖的功能活性[40],如王丹等[14]對發酵前后的鐵皮石斛多糖功能活性進行研究對比后發現,經面包酵母發酵后得到的鐵皮石斛多糖,還原糖含量降低,且體外抗氧化活性和降血糖活性均增強。王文文等[20]將實驗對象分為3組,將發酵麩皮多糖0、100、200 mg/kg BW分別灌胃大鼠,低劑量 (100 mg/kg BW) 發酵麩皮多糖可增強大鼠的免疫能力,機理是通過改變組織中細胞因子含量并調節其盲腸的菌群結構,來增強其免疫活性,表明了發酵麩皮多糖具有一定的免疫活性。于婷等[41]稱發酵后的桔梗提取物中的多糖使機體對DPPH自由基和羥自由基的清除能力有顯著提高,且提取物中的其他物質也表現出一定的抗氧化活性,如多酚類物質和總黃酮類物質,表明了桔梗提取物的抗氧化活性不僅只有多糖成分在起作用,而是多種物質共同作用的結果。由于多糖具有豐富的生物活性,對醫藥、食品等行業有著重要應用意義。雖然多糖的活性作為當前研究熱點,但仍需更深入創新,根據多糖活性不同的用途,依據其多糖理化性質,使用物理、化學等修飾方法,開發出更多的活性,得到更好的應用效果,為多糖的發展奠定基礎。

5 結論與展望

多糖具有多種生物活性,對醫藥學領域與食品保健行業的發展都具有重大意義,應用前景廣泛。盡管目前對于多糖提取的研究已經取得一定成果,但仍存在提取率低、成本高、不易被人體吸收等缺點,目前還只停留在實驗室階段,無法應用到工業化生產上。因此,為開發出高效低耗,大規模生產應用的發酵工藝,還需要做到以下幾點：通過多種方法的聯合優化,優化多糖發酵工藝,深入研究已有方法的發酵機理,探討多糖結構與其功能活性的構效關系,探究多糖生物合成的分子機制,構建多糖模型,尋找多糖生物合成中的關鍵途徑,注重菌株的選育,開發多糖生產菌株的遺傳改造,提高多糖的提取率,充分體現出發酵產品化價值和商業化價值。

總的來說,目前大多研究集中在發酵多糖的提取工藝,相關的生物合成代謝途徑及多糖的作用機理方面還需繼續深入研究。隨著多糖發酵方法和相關科學技術的日益提升,相信在未來會開發出更多高效低耗的多糖提取工藝,奠定大規模生產多糖的基礎,為多糖的開發和應用提供更廣闊的前景。