大米蛋白肽的制備與ACE抑制活性分析

徐珍珍，于秋生，2*，陳天祥，平向莉，曾朱強，程丹

1(無錫金農生物科技有限公司，江蘇 無錫，214174) 2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

食用蛋白改善代謝綜合癥的作用越來越受到世界各國食品及營養學家的關注。目前，已通過采用合適的蛋白酶水解食用蛋白獲得了大量的生物活性肽，包括血管緊張素轉換酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽、降血脂肽、抗動脈粥樣硬化肽等，其中降血壓肽的研究最為廣泛和深入。

化學合成類西藥廣泛應用于高血壓的預防與治療。盡管這些降壓藥物的降壓效果明顯，但仍存在諸多不良反應。來源于動植物及微生物的ACE抑制肽，由于其具有降血壓效果明顯、對正常血壓無影響、無副作用等優點，已成為目前抗高血壓藥物研究的熱點之一[1]。

陳倩倩等[2]對大米蛋白的4種蛋白(清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白)進行酶解后，發現其具有ACE抑制活性。WANG等[3]用蛋白酶酶解提取大豆蛋白肽，用堿性蛋白酶制備的肽表現出ACE抑制活性和抗氧化活性。楊敏[4]采用中性蛋白酶酶解鰈魚魚皮制備的膠原蛋白肽具有ACE抑制活性，其抑制率為52.48%，動物實驗結果表明其對SHR大鼠有降血壓效果。

目前對動植物蛋白肽的ACE抑制活性研究較多，但鮮有不同蛋白肽間對比的研究。本文研究了大米蛋白肽的酶解制備工藝，并對該大米蛋白肽與市售的大豆蛋白肽和魚膠原蛋白肽進行理化指標、分子質量分布和ACE抑制活性進行了研究與對比，可為3種蛋白肽的應用提供更多的基礎數據支持。將該大米蛋白肽的工藝進行放大與生產，測定不同批次大米蛋白肽的ACE抑制活性，研究放大生產產品的穩定性，為大米蛋白肽的工業化生產提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大米蛋白，無錫金農生物科技有限公司；大豆蛋白肽、魚膠原蛋白肽、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶B，市售；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸，上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-6100紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國沃特世公司；FE28 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HYP-320消化爐、KDN103F定氮儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大米蛋白酶解優化實驗

大米蛋白100 g加水，料液比1∶9(g∶mL)，升至50 ℃，調至酶最適pH，以2 000 U/(g蛋白質)加入蛋白酶，50 ℃反應5 h，升溫至90 ℃保溫10 min滅酶，4 000 r/min離心5 min，得上清液，濃縮后進行噴霧干燥，得到大米蛋白肽粉。

1.3.2 大米蛋白肽粉的放大與生產

大米蛋白500 kg，料液比1∶9(g∶mL)調漿，升溫至50 ℃，調至最適pH，以2 000 U/(g蛋白質)加入復合蛋白酶，50 ℃反應5 h，蒸汽噴射物料升溫至90 ℃,保溫10 min進行滅酶，臥螺分離得到上清液，過膜分離設備，經降膜式蒸發器濃縮后進行噴霧干燥，得到大米蛋白肽粉。

1.3.3 蛋白回收率測定

根據GB 5009.5—2016[5]的凱氏定氮法測定其粗蛋白含量，蛋白回收率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 感官評價

本實驗從對苦味、鮮味、咸味敏感的專業人員中篩選10名感官評價員(5名男性，5名女性)組成感官評價小組。味道評分采用5分制(0表示沒有味道，3表示味道適中，5表示味道強烈)。將2 g大米蛋白肽粉溶解在100 mL水中，感官評價人員每次進行感官評價后，立即用清水漱口，以平均值作為最終感官評價得分[6]。

1.3.5 分子質量分布的測定

按照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽》的附錄A[7]測定分子質量分布。

1.3.6 肽含量的測定

按照GB/T 22492—2008 《大豆肽粉》的附錄B[8]測定肽含量。

1.3.7 游離氨基酸的檢測

按照GB/T 22729—2008 《海洋魚低聚肽》的游離氨基酸含量的測定方法[7]測定。

1.3.8 ACE抑制率的測定

參考文獻[9-10]的方法測定ACE抑制率。

1.3.9 ACE抑制肽的結構初探

將大米蛋白肽送至生工生物工程(上海)股份有限公司，采用液相質譜-色譜聯用進行氨基酸序列的測定。

2 結果與分析

2.1 大米蛋白的單酶水解

采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶B分別對大米蛋白進行酶解，蛋白回收率與感官評價得分見圖1與圖2。

1-堿性蛋白酶;2-中性蛋白酶;3-蛋白酶A;4-蛋白酶B(下同)圖1 大米蛋白的單酶水解的蛋白回收率Fig.1 The protein recovery of rice protein hydrolyzed by single enzyme

圖2 大米蛋白的單酶水解感官評價Fig.2 Sensory evaluation of single enzyme hydrolysis of rice protein

由圖1、圖2可知，利用堿性蛋白酶與中性蛋白酶水解大米蛋白，蛋白回收率較高，分別為47.0%和43.2%，但其感官評價中的苦味評分也較高，分別為4.3和3.2分，這與林洋等[11]酶解制備大豆小肽的結果一致。這可能是由于堿性蛋白酶與中性蛋白酶主要水解疏水性氨基酸的羧基以及亮氨酸、苯丙氨酸的氨基，同時由于大米蛋白中谷蛋白占比高達80%，其大量疏水基團暴露，產生苦味較重的小分子肽結構。蛋白酶A主要水解賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的羧基，蛋白酶B主要水解賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸與酪氨酸的羧基，這2種蛋白酶產生相對較少的疏水性基團，苦味產生較少[12]。經過4種單酶酶解后，大米蛋白的鮮味基本一致，咸味略有差異。

2.2 大米蛋白的雙酶水解

由前文可知，堿性蛋白酶與中性蛋白酶水解得到的大米蛋白肽收率高、苦味高，而蛋白酶A與蛋白酶B水解得到的大米蛋白肽口感明顯柔和很多，故將堿性蛋白酶和中性蛋白酶與蛋白酶A和蛋白酶B酶進行1∶1復配，優化酶解結果[13]。

由圖3、圖4可知，采用復合酶對大米蛋白進行復合酶解，堿性蛋白酶與蛋白酶B復合酶解后，蛋白回收率最高，達到43.9%，同時苦味評分明顯下降，為2.2，鮮味、咸味的評分沒有明顯的變化。

1-堿性蛋白酶+蛋白酶A;2-堿性蛋白酶+蛋白酶B;3-中性蛋白酶+蛋白酶A;4-中性蛋白酶+蛋白酶B(下同)圖3 大米蛋白的雙酶水解的蛋白回收率Fig.3 The protein recovery of double enzymatic hydrolysis of rice protein

圖4 大米蛋白的雙酶水解的感官評價Fig.4 Sensory evaluation of double enzymatic hydrolysis of rice protein

4種復合酶制備大米蛋白肽的分子質量分布見表1，堿性蛋白酶與蛋白酶B復合酶水解的肽分子最小，分子質量<1 000 Da的總和與分子質量<2 000 Da的總和均最高，這也與其酶解后蛋白回收率最高相對應。

表1 雙酶水解的分子質量分布 單位：%

4種復合酶制備大米蛋白肽的肽含量和游離氨基酸含量結果見表2，堿性蛋白酶與蛋白酶B復合酶水解的肽含量最高，中性蛋白酶與蛋白酶B復合酶水解的肽含量最低，這與酶解后蛋白回收率相一致。4種復合酶水解后，游離氨基酸的含量相差不大且均較低，這表明4種酶組合均產生較少的游離氨基酸，水解后主要以肽的形式存在。

表2 雙酶水解的肽含量與游離氨基酸含量 單位：%

綜合考慮蛋白回收率、感官評分、分子質量分布、肽含量及游離氨基酸的研究結果，為獲得較高的蛋白回收率與肽含量、口感較好、分子質量較小的大米蛋白肽，選取堿性蛋白酶加蛋白酶B復合酶進行酶解。

2.3 三種蛋白肽的理化指標

采用上述酶解工藝對大米蛋白肽進行放大生產，制備得到大米蛋白肽粉。同時采購市售的大豆蛋白肽、魚膠原蛋白肽，對這3種蛋白肽的水分、蛋白質、脂肪含量等指標進行檢測，結果如表3所示。

從表3可知，這3種蛋白肽的水分含量均<5%，蛋白質含量均>90%，脂肪含量均<1%，跟目前市面常見肽的指標一致。

2.4 三種蛋白肽的分子質量分布

對3種肽進行分子質量分布分析，結果見表4。大豆蛋白肽的分子質量分布最小，其分子質量<1 000 Da的總和最高，為73.14%，大米蛋白肽次之，而魚膠原蛋白肽的分子質量分布最大。

表4 三種蛋白肽的分子質量分布 單位：%

分子質量<2 000 Da的總和，大米蛋白肽最高，大豆蛋白肽與之接近，魚膠原蛋白肽最低。整體來看，大豆蛋白肽和大米蛋白肽的分子質量分布比較接近，而魚膠原蛋白肽的分子質量分布均較高。

2.5 三種蛋白肽的ACE抑制活性對比

ACE在激肽釋放酶-激肽系統中能使舒緩激肽失活，使激肽釋放酶-激肽系統處于抑制狀態，導致血管收縮占優勢，血壓升高。因此抑制ACE的活性是治療高血壓的重要途徑之一[14]。3種蛋白肽的ACE抑制活性曲線見圖5。

圖5 三種蛋白肽的ACE抑制曲線Fig.5 ACE inhibition curves of three protein peptides

如圖5所示，3種蛋白肽對ACE的抑制活性均隨質量濃度的增加而提高。大米蛋白肽在10 μg/mL時，其ACE抑制抑制活性達到87.33%，大豆蛋白肽和魚膠原蛋白肽分別為27.80%和18.18%，這可能與蛋白來源有關。研究發現從酒糟或大米蛋白中酶解可獲得具有較高ACE抑制活性的降血壓活性肽，YOSHIYUKI等[15]水解酒糟大米蛋白，分離出9種具有ACE抑制活性的肽，包括Arg-Tyr與Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr。CHEN等[16]采用堿性蛋白酶水解大米蛋白，得到Val-Asn-Pro和Val-Trp-Pro兩個ACE抑制活性肽段，其IC50分別為6.4 μmol/L和4.5 μmol/L。譙飛[17]將大米蛋白經過乳酸菌2-18、胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解后，肽的ACE抑制率達到(91.95±6.45)%，得到的活性片段為Val-Val-Phe-Phe-Ala-Ala-Ala-Leu。WANG等[18]以納豆菌固態發酵豆粕，發酵產物經分離純化，ACE抑制活性為84.1%，IC50值為0.022 mg/mL。劉文穎等[19]制備大豆低聚肽，得到4種ACE抑制肽段，分別為：Leu-Val-Arg，IC50=51.75 μmol/L；Leu-Tyr，IC50=305.76 μmol/L；Asp-Tyr-Arg，IC50=1 082.95 μmol/L；Asp-Phe，IC50=1 106.04 μmol/L。對5種食源性低聚肽進行ACE抑制活性對比發現，大豆低聚肽比海洋膠原低聚肽的ACE抑制活性高[20]。楊敏[4]將中性蛋白酶制備的鰈魚魚皮膠原蛋白肽進行分離純化，分子質量為300～1 000 Da的寡肽組分的ACE抑制率最高，達72.67%，IC50值為1.72 mg/mL。

如表5所示，大米蛋白肽、大豆蛋白肽、魚膠原蛋白肽的IC50分別為4.97、23.01和35.14 μg/mL，與其ACE抑制活性成反比，與上述的部分研究趨勢一致，但IC50濃度不完全一致，這可能與檢測方法或產品生產制備方法不完全一致有關。大米蛋白肽的ACE抑制活性最高，這可能是由于大米蛋白含有較多的ACE抑制活性片段，經過一系列的酶解反應與處理后，能獲得更多具有ACE抑制活性的大米蛋白肽結構片段。周亞麗[21]測定的陽性對照品卡托普利IC50為1.48 ng/mL，與其相比，這3種食源性蛋白肽的ACE抑制活性較低，但是這3種蛋白肽均來自天然的動植物蛋白質，具有較高的安全性，作用溫和，可以減少或避免化學合成藥物對人體產生的不良反應，滿足人體健康需要，可長期食用。

表5 ACE抑制率擬合曲線Table 5 ACE inhibition rate fitting curve

2.6 大米蛋白肽中ACE抑制肽段的結構初探

對大米蛋白肽進行結構分析，結果見表6。

表6 大米蛋白肽的結構分析Table 6 Structural analysis of rice protein peptide

如表6所示，獲得2條三肽序列、1條四肽序列和1條五肽序列，分子質量在180～500 Da和500～1 000 Da之間，處于大米蛋白肽中分子質量分布最大的范圍內。GUO等[22]研究發現ACE抑制肽C端有帶正電的氨基酸如賴氨酸(Lys)時，具有較高的ACE抑制活性;ZHOU等[23]研究發現N端為支鏈氨基酸，C端含有Tyr、Trp、Phe或Pro的肽的ACE抑制活性更高，這與本文的研究結果相符合。

2.7 不同批次生產的大米蛋白肽的ACE抑制活性穩定性

對該大米蛋白肽的工藝進行中試和工廠放大生產后，取工廠連續生產的3個不同批次的大米蛋白肽樣品進行ACE抑制活性的檢測，研究該產品的ACE抑制活性穩定性，結果見表7。

表7 不同批次生產的大米蛋白肽的ACE抑制活性Table 7 ACE inhibitory activities of rice protein peptides produced in different batches

表7中，不同批次的大米蛋白肽的ACE抑制活性波動不大，ACE抑制率與IC50值基本保持穩定。這說明大米蛋白肽經過放大生產后，ACE抑制活性的穩定性較好，產品的穩定性較好，這也驗證了前期的實驗設計與工藝研究是合理的，可以實現工業化生產。

3 結論

優化大米蛋白肽的單酶水解與雙酶酶解工藝，確定采用堿性蛋白酶加B酶復合酶解，制備的大米蛋白肽蛋白回收率較高，感官評價高、主要為分子質量較小(<2 000 Da)的低聚肽。將研制的大米蛋白肽與市售大豆蛋白肽、魚膠原蛋白肽進行對比，3種蛋白肽的水分含量、蛋白質含量、脂肪含量基本一致。通過對比分析，大米蛋白肽與大豆蛋白肽中分子質量<2 000 Da的蛋白肽總和均大于80%，而魚膠原蛋白肽僅有58.01%。以分子質量<1 000 Da的總和對比看，大豆蛋白肽與大米蛋白肽幾乎是魚膠原蛋白肽的2倍。對比3種蛋白肽均有ACE抑制活性，大米蛋白肽的效果最好，IC50最低，為4.97 μg/mL，僅為大豆蛋白肽IC50的21.6%，為魚膠原蛋白肽IC50的14.1%。對大米蛋白肽的結構進行初步研究，得到4條肽段序列，與現有的ACE抑制肽構效關系研究相符合。經過放大多批次生產后，大米蛋白肽的ACE抑制活性穩定，產品穩定性較好，表明該工藝可以放大實現工業化生產。