黑靈芝多糖緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果

（天津師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst.）是我國(guó)重要的藥食同源真菌資源，屬擔(dān)子菌綱多孔菌科，已有數(shù)千年藥用歷史，具有補(bǔ)氣安神、強(qiáng)身健體等很高的藥用價(jià)值[1-3]。靈芝中主要的活性成分是靈芝多糖，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗衰老和抗腫瘤等功效[4-5]。黑靈芝（Ganoderma atrum）被譽(yù)為靈芝中的極品，對(duì)人體健康具有良好的藥用療效，長(zhǎng)期食用可調(diào)理多種機(jī)能[6]。

運(yùn)動(dòng)性疲勞是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中常見的生理現(xiàn)象，是機(jī)體出現(xiàn)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，如不能及時(shí)消除疲勞可引起精神倦怠、運(yùn)動(dòng)能力下降、免疫力下降等病理現(xiàn)象[7]。通過(guò)補(bǔ)充合理的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或藥物緩解疲勞的產(chǎn)生，是消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的有效措施[8]。鑒于黑靈芝多糖對(duì)人體具有多種調(diào)理機(jī)能，本研究從黑靈芝中分離純化黑靈芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，GAP），研究其抗氧化能力，改善過(guò)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康雄性昆明小鼠50只，5周齡，體重20 g～22 g，SPF 級(jí)[許可證號(hào)：SCXK（京）2019—0002]：北京華阜康生物科技股份有限公司；黑靈芝：江西贛州贛南靈芝基地；紅景天西洋參膠囊：廣州賽健生物科技有限公司。

血乳酸（blood urea nitrogen，BLA）試劑盒、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、蒽酮試劑、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、Na+K+-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶及 Ca2+Mg2+-ATP 酶試劑盒：南京建成生物工程研究所。血清葡萄糖（glucose，GLU）試劑盒：中生北控生物科技。

1.2 儀器與設(shè)備

JD-XSC型小鼠恒溫游泳池：上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LH750血液分析儀：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；BT-3000 Plus全自動(dòng)生化分析儀：意大利Biotecnica公司；XO-SM100超聲微波組合反應(yīng)裝置：南京先歐儀器制造有限公司；FA1204T分析天平：廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；FSH-2型勻漿機(jī)：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；ALPHA1-2真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 黑靈芝多糖（GAP）的制備

黑靈芝子實(shí)體粉碎至200目，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡24 h脫脂，加入100℃純凈水浸提2 h，過(guò)濾，將浸提液旋蒸濃縮至原體積1/5，加入乙醇置于4℃的冰箱中2 h沉淀多糖，3 000 r/min離心30 min，采用Sevag法脫蛋白，然后依次用自來(lái)水透析48 h、蒸餾水透析24 h、超純水透析24 h，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀，沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚各洗滌2次，濃縮，冷凍干燥，得到精制黑靈芝多糖；通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)，純度＞99.8%，通過(guò)高效液相色譜法、紅外光譜法、氣相色譜法、分子大小排阻色譜法及氨基酸分析儀測(cè)得多糖主要為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，其質(zhì)量比為 1∶1.28∶4.91，平均分子量為1 013 kDa[9]。

1.3.2 動(dòng)物分組與灌胃

飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，自然光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水及攝食。小鼠普通飼料飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為黑靈芝多糖低劑量組（GAPL組）、中劑量組（GAPM 組）、高劑量組（GAPH組）、空白組（BC組）、陽(yáng)性對(duì)照組（AG組），每組10只小鼠，共50只。

將黑靈芝多糖制備成濃度分別為2.5、5、10 mg/mL的水溶液，每日灌胃10 mL/（kg·d），即低、中、高劑量組每天分別灌胃25、50、100 mg/（kg·d）黑靈芝多糖；空白組每日灌胃一次蒸餾水10 mL/（kg·d）；陽(yáng)性對(duì)照組按說(shuō)明書推薦用量每日灌胃紅景天西洋參溶液200 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃 30 d。

1.3.3 小鼠體重測(cè)定

試驗(yàn)第0、10、20、30天早上8點(diǎn)稱量小鼠體重并記錄。

1.3.4 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

小鼠末次灌胃30 min后，將鼠尾根部系上其體質(zhì)量5%的鉛條，將小鼠置于游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）中游泳，水深30 cm，水溫（25±1.0）℃。記錄小鼠自游泳開始至鼻孔10 s不能浮出水面的時(shí)間，即小鼠游泳力竭時(shí)間[10]。

1.3.5 血清疲勞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦凈水，眼球取血，在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液血清于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?；檢測(cè)血清乳酸（BLA）、血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作[11]。

1.3.6 肝糖原和肌糖原檢測(cè)

小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦凈水，取血后脫頸處死小鼠取其肝臟和后腿肌肉，用生理鹽水漂洗3遍，用濾紙擦干并稱重，取0.5 g標(biāo)本，按1∶9（質(zhì)量比）加入生理鹽水，并置于冷凍研磨機(jī)中進(jìn)行粉碎勻漿化，勻漿后3 000 r/min離心15 min，取上清液于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?，以分光光度法利用蒽酮試劑測(cè)定肝糖原和肌糖原含量[12]。

1.3.7 肝組織抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

按照1.3.6的方法制備肝組織液，檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、Na+K+-ATP 酶及 Ca2+Mg2+-ATP酶，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)期間小鼠的一般狀況

在試驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠精神狀態(tài)、食欲、睡眠均良好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。黑靈芝多糖對(duì)小鼠體重的影響如表1所示，各組間無(wú)顯著差異。

2.2 黑靈芝多糖對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

黑靈芝多糖對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響見圖1。

由圖1可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間顯著升高（P＜0.05），各組分別升高 37.4%、51.2%、60.3%、53.9%；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑靈芝多糖低劑量組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間降低10.8%，具有顯著性差異（P＜0.05），黑靈芝多糖中、高劑量組對(duì)負(fù)重游泳力竭時(shí)間的延長(zhǎng)能力與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

表1 黑靈芝多糖對(duì)小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of GAP on body weight of mice（±s，n=10）

表1 黑靈芝多糖對(duì)小鼠體重的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of GAP on body weight of mice（±s，n=10）

組別 試驗(yàn)初始體重/g第10天體重/g第20天體重/g第30天體重/g BC 21.32±1.65 25.72±1.50 29.02±1.83 32.16±2.17 AG 21.53±1.41 25.93±1.62 29.69±1.95 32.67±2.54 GAPL 21.61±1.23 25.51±1.37 29.46±1.64 32.08±2.16 GAPM 21.48±1.76 25.09±1.71 28.85±1.79 31.92±2.05 GAPH 21.59±1.57 25.38±1.76 29.17±2.07 32.43±2.71

圖1 黑靈芝多糖對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響（±s，n=10）Fig.1 Effect of GAP on the time of weight-loading swimming exhaustion in mice（±s，n=10）

2.3 黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清抗疲勞效果的影響

黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清抗疲勞效果的影響見圖2。

圖2 黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清抗疲勞效果的影響（±s，n=10）Fig.2 Effect of GAP on anti-fatigue of serum in mice（±s，n=10）

由圖2可知，與空白組比較，黑靈芝多糖組低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中葡萄糖含量顯著升高（P＜0.05），各組分別升高 17.6%、47.9%、58.9%、59.7%；乳酸含量各組顯著降低（P＜0.05），分別降低12.5%、19.0%、22.1%、19.4%；尿素氮含量各組顯著降低（P＜0.05），分別降低 8.7%、16.5%、20.1%、19.6%；肌酸激酶活力各組顯著降低（P＜0.05），分別降低19.5%、37.1%、39.9%、41.4%；乳酸脫氫酶活力各組顯著降低（P＜0.05），分別降低 6.2%、9.4%、11.2%、10.3%；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑靈芝多糖低劑量組血清中葡萄糖含量降低 26.4%，具有顯著性差異（P＜0.05）；乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力均顯著升高（P＜0.05），分別升高 8.6%、13.8%、37.5%、4.5%，黑靈芝多糖中、高劑量組對(duì)葡萄糖儲(chǔ)備的升高能力以及對(duì)乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力的降低能力與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

2.4 黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響見圖3。

由圖3可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肝糖原和肌糖原含量顯著升高（P＜0.05），肝糖原含量各組分別升高61.6%、83.7%、92.6%、87.5%，肌糖原含量各組分別升高25.3%、42.2%、51.8%、45.7%；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑靈芝多糖低劑量組肝糖原和肌糖原含量顯著降低（P＜0.05），分別降低13.8%、14.0%，黑靈芝多糖中、高劑量組對(duì)肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備的升高能力與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

圖3 黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響（±s，n=10）Fig.3 Effect of GAP on the contents of liver glycogen and muscle glycogen in mice（±s，n=10）

2.5 黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響

黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響見圖4。

圖4 黑靈芝多糖對(duì)小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響（±s，n=10）Fig.4 Effect of GAP on antioxidation of serum and liver in mice（±s，n=10）

由圖4可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清和肝組織中丙二醛含量顯著降低（P＜0.05），隨著黑靈芝多糖劑量增加，丙二醛含量降低越明顯；與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清和肝組織中超氧化物歧化酶活力、過(guò)氧化氫酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均顯著升高（P＜0.05），隨著黑靈芝多糖劑量增加，抗氧化酶活力升高越明顯；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑靈芝多糖低劑量組血清和肝組織中丙二醛含量顯著升高（P＜0.05），超氧化物歧化酶活力、過(guò)氧化氫酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均顯著降低（P＜0.05），黑靈芝多糖中、高劑量組對(duì)丙二醛含量的降低能力以及對(duì)超氧化物歧化酶活力、過(guò)氧化氫酶活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的升高能力與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

2.6 黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響

黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響見圖5。

由圖5可知，與空白組比較，黑靈芝多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP 酶活性顯著升高（P＜0.05），Na+K+-ATP酶活性各組分別升高12.8%、27.9%、30.4%、25.1%，Ca2+Mg2+-ATP酶活性各組分別升高15.9%、30.2%、31.7%、28.6%；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，黑靈芝多糖低劑量組肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.05），分別降低 9.8%、10.1%，黑靈芝多糖中、高劑量組對(duì)Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的升高能力與陽(yáng)性對(duì)照組相似。

圖5 黑靈芝多糖對(duì)小鼠肝組織Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響（±s，n=10）Fig.5 Effect of GAP on activities of Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in liver of mice（±s，n=10）

3 討論與結(jié)論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中常見的現(xiàn)象，肝糖原、肌糖原、血乳酸、尿素氮、乳酸脫氫酶活力、肌酸激酶活力、抗氧化酶活力均反應(yīng)機(jī)體的疲勞程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)力竭的時(shí)間，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生[15]。分析其原因發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠力竭游泳后肝糖原、肌糖原、血清中葡萄糖含量均顯著高于空白組，血中乳酸、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脫氫酶活力均顯著低于空白組，表明黑靈芝多糖可以有效增加肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備、減少運(yùn)動(dòng)中能源物質(zhì)的消耗，節(jié)約蛋白質(zhì)分解，降低乳酸、尿素氮等代謝物質(zhì)的產(chǎn)生；緩解力竭運(yùn)動(dòng)中血清肌酸激酶和乳酸脫氫酶活力，避免由于其活力過(guò)高引起骨骼肌、心肌等組織損傷、壞死，保護(hù)肌組織，從而提高機(jī)體對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的耐受能力，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的程度[16]。

高強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)耗氧量劇增，肝臟、骨骼肌和心肌等組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加強(qiáng)，引起體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加[17]。自由基可與體內(nèi)糖類、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)反應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)可以有效清除自由基，保持自由基動(dòng)態(tài)平衡[18]。但力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)自由基產(chǎn)生的過(guò)快過(guò)多，抗氧化系統(tǒng)中的活性物質(zhì)過(guò)多消耗，無(wú)法及時(shí)清理自由基，導(dǎo)致自由基與細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成具有細(xì)胞毒性的過(guò)氧化物，脂質(zhì)過(guò)氧化物可自發(fā)分解成更多的自由基，引起自由基連鎖反應(yīng)[19]。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要代謝產(chǎn)物，其含量升高提示體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)失衡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠血清和肝組織中丙二醛含量顯著低于空白組，超氧化物歧化酶活力、過(guò)氧化氫酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖有效降低力竭運(yùn)動(dòng)中氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，提高抗氧化酶的活力，降低氧化損傷的程度，維持機(jī)體正常的抗氧化防御系統(tǒng)[21]。

Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶分別驅(qū)動(dòng)Na+/K+和Ca2+/Mg2+于細(xì)胞膜兩側(cè)雙向運(yùn)輸，維持細(xì)胞膜電位，催化ATP分解為ADP供能，其活性反映機(jī)體能量代謝水平，機(jī)體自由基、運(yùn)動(dòng)、缺氧等狀況可影響ATP酶活性[22]。力竭運(yùn)動(dòng)中，體內(nèi)過(guò)剩的自由基攻擊Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶，誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變，使酶形成以碳原子為中心的自由基，降低酶的活性[23]。又由于自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及丙二醛作用使細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性改變，細(xì)胞內(nèi) Na+、Ca2+排出受阻，胞內(nèi) Na+、Ca2+濃度增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能失衡，影響細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，降低氧的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減少組織供氧，缺氧又加重自由基的損害作用，進(jìn)一步降低ATP酶的活性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖低、中、高劑量組小鼠肝組織中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性顯著高于空白組，表明黑靈芝多糖有效提高Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，改善能量系統(tǒng)在力竭運(yùn)動(dòng)中的供能能力，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[25]。

綜上所述，黑靈芝多糖通過(guò)增加機(jī)體肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備、減少乳酸、尿素氮、丙二醛等代謝物質(zhì)的積累、提高機(jī)體超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶系的活力以及Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的程度，而且其功效與已具備改善運(yùn)動(dòng)性疲勞藥效的藥物相類似[26]。后續(xù)將對(duì)黑靈芝多糖抗氧化及抗疲勞機(jī)制進(jìn)行深入研究，為黑靈芝多糖開發(fā)為提高運(yùn)動(dòng)能力及抗疲勞的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)劑提供科學(xué)依據(jù)。