發酵食品微生物多樣性分析方法研究進展

夏傲喃，李建華，林祥娜，湯曉娟，劉云國*

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.安徽拓維檢測服務有限公司，安徽 宣城 242000）

發酵食品是指那些利用植物或動物為原料通過天然微生物或添加含有微生物的發酵劑而生產的美味而有營養的產品。這種食品至少有一種成分是被微生物利用，最終產品的理化、感官和酶學特性得到顯著的改變[1]。發酵食品悠久的食用歷史，使其具有原料多樣，產品種類繁多。如酒精飲料、乳制品、豆制品等，常見的食品原料及主要風味特點如表1所示。

表1 發酵食品的原料及其風味特征Table 1 Raw materials and flavor characteristics of fermented food

由于微生物的作用，食品原料中的大分子物質被降解，食品物理化學和感官特性的改變來提高產品附加值，致病性和腐敗微生物的生長被限制[2]，但直到現在，人們對很多發酵食品中潛在的微生物群落也沒有太多的了解。因此，研究發酵食品微生物多樣性具有重要意義，不僅有利于進一步研究微生物與食品的功能，質構和風味的關系，也為食品中有益微生物的篩選和有害微生物的抑制提供基礎。對發酵食品微生物多樣性分析方法進行綜述，為開展發酵食品中微生物多樣性相關研究提供技術基礎。

1 微生物對發酵食品的影響

微生物作為發酵過程的主要支柱之一，在將原料轉化為消費者和生產者都能接受的食用產品方面起著關鍵作用。發酵食品具有微生物功能特性，可以產生一些特殊的營養因子，繼而提高機體功能，如抗氧化[3]、降低有害物質提高營養價值[4]、降低心血管疾病[5]等。發酵食品中的微生物種類、數量和相互作用對發酵過程的順利進行至關重要，也對發酵產品的質量和風味有很大影響[6-7]。微生物的作用產生大量的酶，用于細胞代謝和隨后的小分子生成，這些酶有助于最終產品風味的形成[8]。天貝的發酵過程中使用了根霉菌來增加其維生素、煙酸和核黃素的含量[9]。某些發酵微生物負責降解抗營養物質，從而將其轉化為可食用產品。印度的蒸糕發酵過程中發生的，植物酸含量的降低導致了礦物質、蛋白質和糖的生物利用度的增加[10]。但發酵食品有些時候由于原材料問題或者生產過程不規范，產生一些安全隱患，例如，微生物脫羧氨基酸導致生物胺的形成，這些生物胺可以在一些發酵食品中找到，如酸菜、奶酪、果酒等[11]。在發酵蔬菜中生物胺（例如組胺和酪胺）的產生和危害程度正成為與這些化合物對健康的影響直接相關的經濟問題。關于發酵食品的大量研究論文強調，微生物的積極作用遠比其可能帶來的風險強得多[12]。

2 微生物多樣性分析方法

2.1 傳統方法

傳統方法首先是由培養基對可培養微生物進行篩選，然后通過顯微試驗、生理生化試驗以及分子生物學試驗對純種微生物進行鑒定。傳統的方法其基本原理是通過控制營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求來盡量滿足微生物的生長需求。蔡海鶯等[13]通過傳統方法從12種甜米酒酒曲中得到41株細菌和16株真菌，發現酒曲微生物中含有大量芽孢桿菌，少量病原菌和腐敗菌，真菌除釀酒酵母外，還鑒定出畢赤酵母和扣囊復膜酵母等非釀酒酵母和一些絲狀真菌。孫文麗等[14]通過選擇性培養基對脹氣食醋污染微生物進行分離鑒定，得到貝萊斯芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌等6種菌群，其中特基拉芽孢桿菌能產生氣體，是造成食醋脹氣的主要潛在微生物。凌空等[15]也采用傳統的方法對3種果蔬酵素不同發酵周期中微生物進行分離鑒定，得到7株菌種，其與報道的菌種有異同。然而，傳統的基于培養的方法只能分離一些可培養微生物，大多數微生物不能在培養基中培養[16-17]。因此，近年來在研究發酵食品微生物多樣性時，常將傳統方法與分子生物學方法相結合，更全面地分析發酵食品的微生物多樣性。

2.2 分子生物學方法

雖然傳統方法已被頻繁使用，但它無法捕獲不可培養微生物。因此，可以識別培養和不可培養微生物的多種分子生物技術常用來揭示發酵食品微生物多樣性[6]。變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段長度多態性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）和擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機引物PCR-DNA多態性分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和高通量測序（high throughput sequencing，HTS）是探索食品微生物群落的有效分析工具，多年來在食品和環境微生物學中得到了廣泛的應用。

2.2.1 DGGE/TGGE

DGGE/TGGE是根據DNA在不同濃度的變性劑和溫度中DNA雙鏈解旋的不同而導致電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。其原理是通過16S rDNA基因在含有梯度變性化合物配制的聚丙烯酰胺凝膠中的序列特異性融點不同實現的，從而導致DNA片段的遷移速率不同，這樣不同的片段就被有效分離[18-19]。DGGE是第一個用于米酒發酵劑微生物區系研究的未培養方法[20]，該方法揭示了越南米酒發酵劑中真菌菌群的多樣性和菌群結構。鄒穎玲等通過DGGE技術分析宣威火腿中菌群落結構，表明宣威火腿中含有豐富的菌群，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多樣性最高，加工2年火腿內部真菌群落多樣性最高[21]。顧采東[22]采用TGGE技術研究不同加熱方式對牛乳殺菌的效果，發現在殺菌程度不足時，牛乳會存在假單胞菌，影響牛乳的質量與安全，最佳條件是65℃，處理45 min。除此之外，在酒類[23-24]、木薯飲料[25]、泡菜[26]、發酵茶[27]等也被廣泛應用。DGGE與TGGE不需要培養、檢測極限低、檢測速度快，但基于DNA形態的方法由于通量低、靈敏度低，也難以反映微生物的綜合多樣性。

2.2.2 RFLP、T-RFLP和AFLP

RFLP原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此可以引起酶切位點變異的突變和一段DNA的重新組織等均可導致RFLP的產生。AFLP是在RFLP技術基礎上進一步開發的DNA多態性檢測技術，不需要制備探針，但有較高的鑒別能力和較好的重現性，在物種水平有較好的鑒別效果[28]。李小永[29]通過DGGE和T-RFLP對豆豉發酵過程中微生物多樣性進行研究，發現Shannon指數先下降后上升，然后逐漸下降，豆豉發酵期間中微生物發生很大的改變。Braulio等[30]用一種簡化AFLP方法對葡萄酒發酵過程中酵母進行分類，從自然發酵的葡萄酒中分離出的180個菌落分為11個不同的菌株，6個不同的菌株，4個不同的菌株和11個不同的菌株。AFLP指紋技術的發展和應用，使微生物遺傳多樣性和分類學研究取得了重大進展，但實驗操作繁瑣，成本較高。

2.2.3 RAPD

RAPD是以堿基順序隨機排列的寡核苷酸單鏈為引物，以組織中分離出來的基因DNA為模板進行PCR擴增。由Williams建立的RAPD技術的優點是信息豐富、成本效益高、可靠、可重復的方法[31]。楊勇等[32]優化了RAPD技術在發酵肉制品微生物多樣性擴增條件，并闡述了RAPD技術的優點，并在植物和動物中得到廣泛的應用。秦丹[33]通過RAPD技術分析了四川香腸和臘肉加工儲藏過程中微生物多樣性，得出四川香腸和臘肉中優勢菌群為乳酸菌和葡萄球菌，煙熏對微生物尤其是酵母菌生長影響顯著，并通過傳統方法與RAPD技術比較發現兩種方法檢測到的微生物多樣性結果不完全一致。但由于RAPD技術采用隨機引物進行PCR擴增，得到很多大小不一的DNA片段，造成條帶多而雜，給遺傳多樣性的分析造成了困難，導致結果穩定性和重復性較差。

2.2.4 HTS

HTS（又稱“第二代測序技術”）的發展使得許多生物學領域發生了革命性的變化，包括醫學微生物學、植物和動物基因組學，以及基因轉錄的研究。HTS產生大量數據，樣品間重復性好，能夠同時篩選多個不同的基因組區域。已廣泛應用于食品領域中，例如，更準確地識別產品中的絕大多數微生物分類群，包括那些不能培養的微生物和那些只有少量存在的微生物，極大地擴展了微生物生態學領域[34]。HTS包括ABI SOLiD連接法測序、454焦磷酸測序和Illumina Solexa合成測序，其中Illumina測序是最廣泛應用于探索環境和人體微生態系統的微生物多樣性[35-36]。Illumina測序讀長較短，測序通量較高，能夠同時篩選多個不同的基因組區域，從而能夠識別食品中所有植物、動物、真菌和藻類成分，已廣泛應用于發酵食品微生物的分析，極大地改變了人們對發酵食品微生物學的認識，是評價食品中微生物多樣性和監測食源性病原體的有效工具[37-39]。

HTS方法也被用于許多發酵食品的微生物菌群結構和微生物演替的鑒定。Moeun Lee等[40]通過Illumina MiSeq技術對韓國25份泡菜的微生物多樣性進行分析，并發現不同樣品泡菜微生物優勢菌群較大，尤其在發酵初期，為泡菜的研發和質量控制提供基礎。Alejandro等[41]通過454焦磷酸測序技術對奶酪的微生物多樣性進行分析，比較了生牛乳、發酵乳清、凝乳和成熟奶酪的微生物菌群，發現生牛乳樣品的細菌群落多樣性最高，干酪、凝乳和乳清的多樣性較低。Aregbe等[6]通過高通量16S技術分析了5種不同前處理的馬鈴薯產品的微生物多樣性，得到魏氏菌屬和酵母菌屬為優勢菌屬，蒸發處理的馬鈴薯發酵產品中含有魏氏菌和葡萄糖乳桿菌，可降低pH值，抑制微生物的生長。楊春敏等[42]通過高通量16S和ITS分析了來自于海南的6份米酒酒曲的微生物菌群和結構，闡述了微生物群落與米酒的質量和風味關系。

2.3 多種技術聯合的應用

由于每種微生物多樣性研究方法的局限性和不足，為了更全面的了解發酵食品的微生物多樣性和菌群特點，各種技術相結合在微生物多樣性分析中很普遍。Deng等[43]通過傳統方法對鯛魚中的細菌、酵母和絲狀真菌進行了計數，通過高通量16S和ITS測序技術對鯛魚儲藏50 d微生物多樣性和菌群變化進行分析。Hou等[44]通過高通量測序技術分析了菜籽粕不同發酵條件微生物多樣性，并通過傳統方法分離鑒定了一株產熱蛋白酶嗜熱嗜硬脂桿菌，并發現在50%的含水量、55℃和24 h的發酵時間下，嗜熱嗜硬脂桿菌的多肽產率最高（9.67%）。Li等[45]通過熒光原位雜交、下一代測序和化學分析等方法對茶餅發酵過程中微生物的豐度、菌群結構和化學成分進行了測定，發現發酵過程中微生物總數為每克樣品2.310 2個～4.010 8個，以真菌為主。

3 展望

隨著人們對微生物的研究越來越深入，以及分子生物學和生物信息技術的不斷發展，為微生物多樣性研究提供了更簡便，快捷的方法，也加深了人們對發酵食品微生物群落的評估和理解。由于每種方法都有其局限性和不足之處，只有將多種方法相結合，才能更客觀全面的了解發酵食品微生物多樣性和菌群結構，這也將會成為未來發酵食品微生物研究的一個發展趨勢。發酵食品微生物多樣性研究將為益生菌的篩選、食品保鮮、延長貨架期、提高產品附加值等提供理論基礎，從而推動有關科學的發展。