枇杷酵素自然發(fā)酵過程中有機(jī)酸及其抗氧化活性的研究

付龍威，湯曉娟，林祥娜，張艷珍，劉云國*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl]屬薔薇科植物，其花、果、葉均可入藥。成熟枇杷鮮果不僅酸甜可口、營養(yǎng)豐富，具有止咳潤肺、消炎鎮(zhèn)痛、延緩衰老等生理功效[1]；還具有抗動脈硬化、抗血栓、抗胃潰瘍、抗菌、抗突變的生物活性及皮膚保健和美容等功效[2]，是進(jìn)行果蔬深加工的良好原料。枇杷是一種季節(jié)性水果，應(yīng)季的時候產(chǎn)量較大，且不耐儲存和運(yùn)輸，極易變質(zhì)[3]。因此解決枇杷短期量大的問題備受關(guān)注。

目前枇杷果實(shí)除鮮食外，其加工產(chǎn)品仍然以果汁、罐頭、果醬以及干制為主，少量的枇杷酒及醋飲料[4-5]，枇杷的深加工及其綜合利用還有待加強(qiáng)，目前尚未見枇杷酵素的報道。食用植物酵素（edible plant enzyme）是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，經(jīng)多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性發(fā)酵產(chǎn)品。研究表明，酵素可有效地清除體內(nèi)過剩的自由基，在預(yù)防和治療因自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。目前酵素品類繁多，但品質(zhì)差別大，且相關(guān)科學(xué)研究支撐不足，亟需深入開展酵素發(fā)酵過程功能組分和功效研究，進(jìn)而用標(biāo)準(zhǔn)化手段規(guī)范傳統(tǒng)工藝，保證酵素品質(zhì)。

本研究以枇杷酵素為研究對象，通過測定枇杷自然發(fā)酵過程中pH值、可滴定酸、有機(jī)酸、總酚含量變化來分析枇杷發(fā)酵過程中活性成分的變化；以DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力為抗氧化性指標(biāo)，評價枇杷酵素的抗氧化活性，為枇杷酵素的綜合開發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷：采自莆田地區(qū)；白砂糖（食品級）：上海怡神保健食品有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸：上海源葉生物科技有限公司；乳酸、乙酸、無水酒精、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、焦性沒食子酸、過硫酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚，2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）（均為分析純）：北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；福林酚（10%）溶液：北京索萊寶生物科技有限公司；濃鹽酸、濃硫酸、過氧化氫（均為分析純）：煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；WT-B千分之一分析天平：杭州萬特衡器有限公司；SHZ-S（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：上海力辰邦西儀器科技有限公司；BEST超純水機(jī)：上海芷昂儀器有限公司；DZF-6094真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Mikro-220R離心機(jī)：德國Hettich科學(xué)儀器公司；752紫外分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DW-86L626海爾超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；Eppendorf移液槍：德國艾本德股份公司；PHS-3C雷磁pH計：上海雷磁儀器廠；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海資一儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枇杷酵素的制備

無菌水清洗枇杷2遍～3遍，于超凈臺晾干，切片、去除核，枇杷∶糖（1∶1，質(zhì)量比），加入無菌水，25℃左右自然發(fā)酵，pH值在3～4之間發(fā)酵結(jié)束。定期取樣，將樣品離心后的上清液保存于-80℃超低溫冰箱中待測。

1.3.2 pH值和可滴定酸的測定

使用精密pH計測定酵素樣品的pH值。

可滴定酸含量的測定方法參考文獻(xiàn)[8]，結(jié)果以乳酸質(zhì)量濃度（g/100 mL）計。

1.3.3 酵素中有機(jī)酸含量的測定

待測樣品用去離子水稀釋5倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定酵素中的有機(jī)酸含量。色譜條件：色譜柱為Aminex@HPX-87H Exclusion Column柱（300 mm×7.8 mm），流動相為0.275%（體積比）的濃硫酸溶液，流速0.4 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長210 nm。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力的測定方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除能力的測定方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.8 超氧陰離子自由基清除能力的測定

超氧陰離子自由基清除能力的測定方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.9 綜合評價指標(biāo)分析

綜合評價指標(biāo)分析的測定方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用origin 9.1進(jìn)行繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 25軟件進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析和主成分分析，當(dāng)P＜0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷酵素發(fā)酵過程中pH值與可滴定酸的變化

枇杷發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸含量的變化如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸含量的變化Fig.1 Changes in pH value and total titratable acidity during the enzyme fermentation

由圖1可知，pH值和可滴定酸含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)相反的變化趨勢。pH值在50 d內(nèi)由（4.920±0.130）迅速下降至（3.37±0.017）（P＜0.05），后緩慢上升直至穩(wěn)定于3.5左右。發(fā)酵過程中，可滴定酸在50 d達(dá)到最大值，由（0.048±0.026）g/100 mL 上升至（0.315±0.022）g/100 mL（P＜0.05），50 d 后有所下降并保持平穩(wěn)（P＞0.05）。發(fā)酵前期可滴定酸含量的快速上升是由于自然發(fā)酵過程微生物代謝產(chǎn)生的醋酸、乳酸等多種有機(jī)酸所致[14]。發(fā)酵50 d后可滴定酸含量下降可能是因?yàn)榻湍妇任⑸锝到獠糠钟袡C(jī)酸，導(dǎo)致乳酸、乙酸含量下降[15]。

2.2 酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

自然發(fā)酵酵素中酵母菌、醋酸菌和乳酸菌是最常見的微生物[16]。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。枇杷酵素中乳酸和乙酸含量的變化如圖2。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of organic acids

圖2 發(fā)酵過程中乳酸和乙酸含量的變化Fig.2 Changes in lactic acid and acetic acid contents during the enzyme fermentation

發(fā)酵過程中乳酸和乙酸含量呈先上升后下降的趨勢。乳酸在第5天沒有檢測出，10 d～20 d由（0.33±0.02）mg/mL 增長到（1.82±0.68）mg/mL，增幅達(dá)451.52%（P＜0.05），20 d以后緩慢增加，在第40天達(dá)到最大值（2.09±0.05）mg/mL。乙酸在前20 d增加且第20天達(dá)到最大值（2.67±0.65）mg/mL（P＜0.05），之后緩慢下降至（1.48±0.03）mg/mL。枇杷酵素中的有機(jī)酸除植物材料中固有有機(jī)酸溶出外，主要由發(fā)酵過程中大量繁殖的產(chǎn)酸微生物代謝生成，而發(fā)酵后期有機(jī)酸減少可能一方面由于糖類物質(zhì)消耗，微生物利用有機(jī)酸作為碳源，或較低pH值抑制部分微生物生長，導(dǎo)致有機(jī)酸含量略有下降[17]，另一方面可能因?yàn)樵谖⑸锏淖饔孟孪挠袡C(jī)酸和單糖產(chǎn)生芳香味的酯類有關(guān)。20 d～40 d之間，乙酸緩慢減少，乳酸緩慢增加可能因?yàn)槿樗峋ㄟ^糖代謝生成乳酸，在厭氧條件下還可將乳酸氧化轉(zhuǎn)化為乙酸[18]。

2.3 酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。以沒食子酸為標(biāo)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.001 3x-0.026 5，R2=0.999 6。酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖3所示。

發(fā)酵前15 d，總酚含量緩慢上升，可能與發(fā)酵前期枇杷在高滲透壓的環(huán)境中多酚類物質(zhì)溶出有關(guān)。發(fā)酵20 d～30 d總酚含量快速上升（P＜0.05），于 30 d達(dá)到最大值（2.08±0.06）mg/mL，這可能與隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在微生物作用下，單體酚類物質(zhì)的合成所致[19]。30 d后總酚含量降低（P＜0.05），可能是由于在發(fā)酵過程中多酚氧化酶被活化，促進(jìn)多酚發(fā)生氧化生成褐色物質(zhì)[20-21]，顏色加深；小分子的酚類物質(zhì)被微生物降解[22]。

圖3 發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.3 Changes in total phenolic content during the enzyme fermentation

2.4 酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于判斷抗氧化劑的清除自由基能力[23]。枇杷酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力變化Fig.4 Changes in DPPH free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢。枇杷酵素的DPPH自由基清除率在5 d～20 d之間由（32.88±2.08）%迅速上升至（87.45±1.20）%（P＜0.05），增幅達(dá)到165.97%，20 d～40 d之間變化幅度較小（P＞0.05），并于發(fā)酵 30 d時達(dá)到最高的（87.54±1.2）%，40d以后清除能力下降。研究表明隨著時間延長DPPH自由基清除率呈快速上升后緩慢下降的趨勢[24]。

2.5 酵素發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率的變化

枇杷酵素發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率的變化如圖5所示。

發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率呈迅速上升后下降的趨勢。發(fā)酵前25 d，ABTS+自由基清除率從（45.00±0.48）%快速上升至（91.93±0.65）%（P＜0.05），增幅達(dá)到104.29%。隨后清除率下降，并于第60天降到（57.99±4.81）%（P＜0.05），隨后又上升。本研究結(jié)果與百合酵素清除ABTS+自由基的變化相似[25]。賈仕杰等[26]研究表明酚類物質(zhì)與ABTS+自由基的清除能力具有顯著的正相關(guān)性。

圖5 發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力變化Fig.5 Changes in ABTS+free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

2.6 酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化

羥自由基是氧自由基中最為活潑的自由基，過量的羥自由基會引起生物分子的嚴(yán)重?fù)p傷。枇杷酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化如圖6所示。

圖6 發(fā)酵過程中羥自由基清除能力變化Fig.6 Changes in hydroxyl free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

發(fā)酵過程中羥自由基清除率呈先上升后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵前40 d，羥自由基清除率從（17.17±0.48）%快速上升至（52.09±0.65）%（P＜0.05），增幅達(dá)203.38%，隨后清除率下降至（35.96±0.2）%（P＜0.05）。羥基自由基清除能力的提高可能是由于酵素中多種有機(jī)酸綜合作用的結(jié)果[26]；也有研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羥基自由基清除能力[27]；酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的羥自由基的清除能力[28]。

2.7 酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化

超氧陰離子自由基在活性氧物質(zhì)的形成中起重要作用，主要損害細(xì)胞膜[29]。枇杷酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化如圖7所示。

發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除率呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵前 50 d，由（12.90±0.10）%上升至最高（49.7±0.65）%（P＜0.05），增幅達(dá) 285.27%，隨后清除率下降。酚類物質(zhì)具有清除超氧陰離子自由基能力[29]，超氧陰離子自由基清除能力與酚類物質(zhì)變化趨勢一致，與蔣增良等[30]研究的葡萄酵素自然發(fā)酵過程中對超氧陰離子自由基的清除能力的趨勢相似。

2.8 相關(guān)性分析

根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果見表2。

枇杷酵素發(fā)酵過程中4種體外抗氧化性指標(biāo)均與總酚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），其中與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；乳酸與4種體外抗氧化性呈極顯著關(guān)系（P＜0.01），乙酸與DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。說明酵素中的酚類物質(zhì)和有機(jī)酸具有一定的抗氧化性作用。

圖7 發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除能力變化Fig.7 Changes in superoxide anion free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

表2 枇杷酵素各參數(shù)相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of various parameters loquat enzyme

表3 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 3 The eigenvalue，contribution rate and the cumulative contribution rate of principal components

2.9 主成分分析

為了進(jìn)一步明確枇杷酵素中各變量之間的相互關(guān)系，通過主成分分析對各變量進(jìn)行降維處理。枇杷酵素主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率見表3。旋轉(zhuǎn)載荷見表4。

以特征值1.0為納入標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化出2個主成分。枇杷酵素的第 1主成分（principal component 1，PC1）貢獻(xiàn)率為63.694%，第2主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為23.125%，前2個主成分的累積貢獻(xiàn)率為86.819%，符合主成分分析的要求。PC1反映了pH值、可滴定酸、總酚、乳酸、羥基自由基清除率和超氧自由基清除率的變異信息，PC2反映了乙酸、ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率的變異信息。通過主成分分析對原先的9種變量指標(biāo)進(jìn)行處理后獲得F1、F2兩個新變量，通過公式計算綜合評價指標(biāo)（comprehensive evaluation indexes，CEI），CEI=（5.732F1+2.081F2）/（5.732+2.081）。

表4 旋轉(zhuǎn)載荷Table 4 Rotation component matrix

不同時間枇杷酵素的CEI值如圖8。

圖8 枇杷酵素發(fā)酵過程中綜合評價指標(biāo)圖Fig.8 Comprehensive evaluation index of loquat enzyme during fermentation process

發(fā)酵第5天時CEI值最低為-1.774，發(fā)酵第40天時CEI值最高為0.909。發(fā)酵前25 d，CEI值快速上升；發(fā)酵25 d～40 d，CEI值較為穩(wěn)定；發(fā)酵40 d以后，CEI值逐漸下降。因此可判斷枇杷酵素的發(fā)酵終點(diǎn)為40 d。

3 結(jié)論

本文采用不同的自由基體系和Pearson相關(guān)分析對枇杷酵素體外抗氧化活性進(jìn)行了較為全面的研究。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，枇杷酵素對ABTS+自由基和DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除作用，并對羥自由基和超氧陰離子自由基也有一定的清除作用，這表明枇杷酵素能夠清除體內(nèi)多余自由基，具有較好的抗氧化能力。枇杷酵素中富含的乳酸、乙酸和多酚類化合物等活性成分，具有良好的抗氧化活性。綜合考慮時間成本與CEI值，發(fā)酵至40 d時CEI值達(dá)到最大，因此確定枇杷酵素的發(fā)酵終點(diǎn)為40 d。