西蘭花蘿卜硫苷提取物的抑菌及體外免疫活性探究

張睿，于建麗，宋璇，閆媛媛，李超，4*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.食品生物技術教育部工程研究中心（天津科技大學），天津 300457；3.天津市利民調料有限公司，天津 300308；4.天津食品集團有限公司，天津 300074）

西蘭花素有“蔬菜皇冠”之美譽，其中富含人體所需的基本營養物質和多種活性成分，如硫代葡萄糖苷[1]、多酚[2]、維生素 C[3]等。硫代葡萄糖苷（硫苷）為含有硫和氮的陰離子的植物親水性次生代謝產物，其結構如圖1所示[4]。

圖1 硫代葡萄糖苷結構Fig.1 The structure of glucosinolate

硫苷廣泛存在于十字花科蕓苔屬植物中，在西蘭花中尤為豐富，且主要以蘿卜硫苷（glucoraphanin，GRA）的形式存在（相對豐度為55.5%）[5-6]。由于GRA具有抗氧化[7]、抑菌[8]、抗癌[9-10]以及免疫調節[11]等多種生物活性，是天然功能性產品的理想原料[12]，因而受到國內外專家及學者的廣泛關注。

近年來，隨著我國農作物栽培技術的不斷改進和提高，西蘭花的單位產率逐年上升，當前種植面積已超過2萬公頃[13]。但值得注意的是，西蘭花的花莖和花蕾為主要食用部分，一個完整的西蘭花在生產環節會有50%～80%的副產物產生[14]。然而，目前我國對于西蘭花副產物的開發利用程度有限，除髙溫堆悶腐熟成為有機肥料外，更多的處理方式則為就地掩埋和壓土覆蓋，由此造成了一定的資源浪費[15]。此外，由于西蘭花副產物中的含硫化合物，如：二甲基二硫醚、異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯等，較易揮發，也會在一定程度上引起環境污染[6]。因此，對于西蘭花副產物的綜合加工利用成為亟待解決的問題。本研究以西蘭花加工副產物為研究對象，采用水提法提取其中的天然活性物質（GRA），并分析其抑菌活性以及體外免疫調節活性，為西蘭花副產物的綜合加工利用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花：塘沽金元寶農貿市場；蘿卜硫苷標準品（純度：99.9%）：上海源葉科技有限公司。RPMI-1640培養液、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化液、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）：美國Gibco生物科技公司；DMEM高糖培養液：美國Hyclone生物科技公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）：天津市百賽斯生物科技有限公司；甲酸、甲醇：天津博歐特化工貿易有限公司；肉湯培養基（luria-bertain，LB）：北京陸橋技術股份有限公司；細胞培養瓶、細胞培養皿：美國Corning公司；0.22 μm聚醚砜微孔濾膜：北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20ATVP高效液相色譜儀、Shim-pack GIST C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：日本島津公司；IQuip 25 μL液相（平頭）微量進樣器：北京芯硅谷科技有限公司；MULTISKAN GO全波長酶標儀、150i型CO2細胞培養箱：美國Thermo公司；HF-safe900型超凈臺：上海力申科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 確定檢測方法

參考李寧的方法[16]，確定本試驗的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件為流動相：0.01%甲酸水溶液:甲醇=95∶5；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；采集時間：15 min；柱溫：30 ℃。

1.3.2 檢測方法的可靠性分析

1.3.2.1 重復性分析

平行制備6份相同濃度的GRA標準品（1 mg/mL），經0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾后，按照1.3.1條件進行檢測分析。根據測試結果的相對標準誤差（relative standard deviation，RSD）值，分析 HPLC方法的可重復性。

1.3.2.2 精密性分析

將1 mg/mL的GRA標準品，經0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾后，按照1.3.1條件進行檢測分析，連續進樣6次。根據測試結果的RSD值，分析HPLC方法的精密性。

1.3.2.3 穩定性分析

將1 mg/mL的GRA標準品，經0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾后，按照 1.3.1 條件，分別于 0、2、4、6、8、10 h后進行測定分析，每組試驗重復進樣3次。根據測試結果的RSD值，分析HPLC方法的穩定性。

1.3.2.4 加標回收率分析

采用加標回收法對HPLC方法的回收率進行分析。吸取1 mL已知含量的GRA樣品溶液（濃度分別為103.31、96.72、98.80 μg/mL），向其中分別加入 1 mL GRA 標準品溶液（100 μg/mL），經 0.22 μm 聚醚砜微孔濾膜過濾后，按照1.3.1條件進行檢測分析，每次重復進樣3次。根據測試結果的RSD值，分析HPLC方法的回收率[17]，計算公式如式（1）所示。

1.3.3 西蘭花中GRA的提取

西蘭花樣品主要前處理工藝過程，如圖2所示。

圖2 樣品前處理工藝流程Fig.2 Sample pretreatment process

參考 Ishida、Grosser等的研究方法[18-19]，西蘭花莖、葉等經切分處理后立即進行沸水滅酶處理（30 s），隨后置于熱風干燥箱中（50℃～65℃）干燥至恒重，經粉碎機磨粉后過80目篩。采用水提法對西蘭花粉中的GRA進行提取，以水作為提取劑，料液比1∶16（g/mL），提取溫度62℃，提取時間10 min，提取次數2次。采用HPLC對提取液中的GRA含量進行檢測。

1.3.4 蘿卜硫苷提取物（glucoraphanin extract，GRAE）的制備

采用冷凍干燥法對GRA提取液進行干燥處理[20]。將GRA提取液置于平皿中，表面封保鮮膜并留孔，于-20℃預凍4 h至固體狀態。然后，將預凍后樣品轉移至預冷-50℃的凍干機中，在冷阱溫度-80℃的條件下，冷凍干燥至恒重，即得GRAE，再次稱重。根據式（2）計算出GRAE的提取率。

1.3.5 主要成分分析

稱取5 mg GRAE，制備為5 mg/mL的樣品溶液，經0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾后，采用外標法進行HPLC分析檢測，以測定GRA的含量。采用苯酚-硫酸法測定GRAE中多糖含量，Folni-Ciocaltue法測定多酚含量，間羥基聯苯比色法測定糖醛酸含量，Bradford法測定蛋白質含量。

1.3.6 抑菌活性分析

1.3.6.1 抑菌圈定性試驗測定

采用濾紙片法分析GRAE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌活性。吸取100 μL活化后的菌懸液，涂布于含LB固體培養基的培養皿中，靜置30 min。隨后將浸泡于GRAE樣品溶液中（100、500、1 000 μg/mL）濾紙片（直徑為5.5 mm）均勻分散于培養基上，先正置15 min，再于37℃條件下倒置培養18 h。以無菌水作為空白對照，硫酸卡那霉素溶液作為陽性對照（20 μg/mL），測量抑菌圈直徑并拍照保存。

1.3.6.2 最小抑菌濃度測定

采用96孔板二倍稀釋法，測定GRAE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）值。取無菌96孔板，在孔板A～D行的第1個孔各加入100 μL的GRAE溶液（2 000 μg/mL），然后對其依次進行二倍稀釋至最后一孔，并將最后一孔的樣液吸棄100 μL。隨后向每孔中加入稀釋好的菌液100 μL，進行無菌密封，置于37℃恒溫培養箱中靜置培養24 h。以菌液作為陽性對照，LB培養基作為陰性對照，利用酶標儀測定600 nm處的吸光度值。

1.3.7 體外免疫調節活性分析

1.3.7.1 細胞增殖能力測定

采用 MTT 法，測定 GRAE（50、100、250、500、1 000 μg/mL）對巨噬細胞株（RAW264.7細胞）增殖能力的影響。首先，將 RAW264.7 細胞懸液（5×104個/mL）接種于 96 孔板（100 μL/孔），于 37℃、5% CO2濃度條件下培養6 h。吸棄上清液，并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate bufter saline，PBS）緩沖液洗滌 2次，再向每孔中分別加入 100 μL 含不同濃度（50、100、250、500、1 000 μg/mL）GRAE 的 DMEM 細胞培養液，于相同條件下培養36 h。然后，向每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h。吸棄舊培養液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，于酶標儀中振動孵育20 min。以DMEM培養液作為空白對照，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）作為陽性對照（1 μg/mL），測定 570 nm 處的吸光度值，按照式（3）計算細胞活度。

1.3.7.2 細胞吞噬能力測定

采用中性紅法，測定GRAE對RAW264.7細胞吞噬能力的影響。首先，將RAW264.7細胞懸液（5×104個/mL）接種于 96 孔板（100 μL/孔），于 37℃、5% CO2濃度條件下培養6 h。吸棄上清液，并用磷酸鹽（phosphate buffer solution,PBS）緩沖液洗滌2次，再向每孔中分別加入 100 μL 含不同濃度（50、100、250、500、1 000 μg/mL）GRAE 的 DMEM 細胞培養液，于上述相同條件下培養36 h。吸棄舊培養液后，于每孔中加入0.1%的中性紅溶液（100 μL）。靜置20 min后，再向每孔中加入細胞裂解液（200 μL），于酶標儀中振動孵育20 min。以DMEM培養液作為空白對照，脂多糖（LPS）作為陽性對照（1 μg/mL），測定 490 nm處的吸光度值。

1.3.8 數據處理

試驗數據以平均值±標準偏差表示，每組試驗重復3次，細胞試驗至少設置5個復孔。圖表繪制使用Origin Pro 8.0和Excel 2016軟件；數據分析使用IBM SPSS 21.0 Statistics軟件。

2 結果與討論

2.1 HPLC檢測方法的建立

2.1.1 HPLC檢測方法的可靠性分析

2.1.1.1 重復性分析

平行制備6份GRA標準品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件測定HPLC色譜圖，分別計算相應峰面積的RSD值，結果如表1所示。

表1 HPLC檢測方法的重復性測試Table 1 Repeatability test of HPLC detection method

由表1可知，6份待測樣檢測后峰面積的RSD值為1.04%（＜2%），表明該HPLC法的重復性良好。

2.1.1.2 精密度分析

精密吸取100 μg/mL的GRA 標準液，按“1.3.1”色譜條件下連續進樣6次，測定各待測品的峰面積，計算其RSD值，結果如表2所示。

表2 HPLC檢測方法的精密度測試Table 2 Precision test of HPLC detection method

由表2所示，6次進樣峰面積的RSD值為0.43%（＜2%），表明該HPLC檢測方法的精密度較高。

2.1.1.3 穩定性分析

配制1 mg/mL的GRA標準品，按“1.3.1”色譜條件下分別于 0、2、4、6、8、10 h 后進行測定分析，得到相應的峰面積值，計算RSD值，結果如表3所示。

表3 HPLC檢測方法的穩定性測試Table 3 Stability test of HPLC detection method

由表3可知，HPLC峰面積的RSD分別為1.90%（＜2%），表明供試品在10 h內穩定性良好。

2.1.1.4 加標回收率分析

加標回收率值常用于評價分析方法是否適合被測基體，也可以反應分析人員的操作技術水平。取1 mL已知含量的GRA樣品溶液（濃度分別為103.31、96.72、98.80 μg/mL），向其中分別加入 1 mL 的 GRA 標準品溶液（100 μg/mL），按“1.3.1”色譜條件下進行檢測分析，將其結果扣除樣品的測定值，而得到加入標準物質的回收率[17]。加標回收率結果及其RSD值，如表4所示。

由表4可知，GRA的平均回收率為96.47%（處于95%～105%的閾限范圍內），RSD為1.50%（＜2%）表明該HPLC方法適用于西蘭花中GRA的含量測定。

表4 HPLC檢測方法的加標回收率測試Table 4 Standard recovery test of HPLC detection method

綜上所述，本試驗建立的HPLC檢測方法，前處理操作簡便，分析時間短，加標回收率較高，重復性、精密度、穩定性良好，能夠定量檢測西蘭花中GRA含量。

2.1.2 HPLC檢測譜圖

采用HPLC法對標準品與西蘭花樣品中的GRA進行檢測，結果如圖3所示。

圖3 GRA的高效液相色譜圖Fig.3 The high performance liquid chromatography of GRA

由圖3可知，GRA標準品與西蘭花樣品的保留時間分別為4.351 min和4.317 min。以HPLC檢測的出峰面積為縱坐標，以GRA標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖4所示。

由圖4可知，GRA的標準曲線方程為y=10 535x+70 180，相關度R2=0.999 8。表明擬合程度較好，可用于西蘭花中GRA含量分析[21]。

2.2 GRAE成分分析

參考王向陽等[22]研究，本試驗對冷凍干燥制備所得的蘿卜硫苷提取液（GRAE）中主要成分進行了初步鑒定，為后期進一步探討其活性作用機制提供基礎數據，其主要成分如表5所示。

圖4 GRA標準曲線Fig.4 The standard curve of GRA

表5 GRAE的化學成分Table 5 The chemical composition of GRAE

Ares等曾對近五年西蘭花中的活性成分做一總結，其結果如下：多酚28%、多糖（硫代葡萄糖苷及其相關化合物）33%、蛋白質4%、脂肪13%、維生素14%、其它物質8%。其中，多酚與多糖含量與本試驗結果基本一致，而蛋白質含量相差較大，這可能由于西蘭花產地、提取物的制備方式及試驗檢測方式不同有關[23]。

2.3 GRAE的抑菌活性探究

2.3.1 抑菌圈試驗測定

通常采用抑菌圈法對待測樣品的抑菌活性進行定性分析，利用待測樣品在培養皿中擴散，使其周圍細菌的生長受到抑制，進而形成透明的抑菌圈，根據抑菌圈直徑可以直觀判定待測樣品的抑菌效果。本試驗采用濾紙片法對GRAE的抑菌活性進行定性分析，結果如圖5及表6所示。

圖5 抑菌圈試驗結果圖Fig.5 The results of bacteriostatic circle test

由表6可知，當GRAE作用濃度為1000μg/mL時，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（19.21±0.29）、（19.10±0.42）、（16.78±0.86）mm，表明3株致病菌對GRAE均呈現出高度敏感性，因而GRAE可以抑制3株致病菌的生長[24]，且對大腸桿菌、沙門氏菌的抑制效果優于金黃色葡萄球菌。

表6 抑菌圈試驗結果匯總Table 6 The summary of bacteriostatic circle test results

2.3.2 最小抑菌濃度測定

最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）是指在體外培養細菌一定時間后，可以抑制培養基內病原菌生長的最低作用濃度，是測量待測菌對抗菌藥物敏感度大小的一個指標[25]。本試驗結果表明GRAE對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC值，分別為 62.5、31.25、250 μg/mL，說明 GRAE 可直接作用于致病菌并產生抑制作用，且對沙門氏菌和大腸桿菌的抑制效果優于金黃色葡萄球菌，該測定結果與抑菌圈試驗結果具有一致性。這可能由于提取物中的GRA（相對分子質量：437.5）作為水溶性小分子[25]，被待測菌株的外膜選擇性透過，進而使細菌細胞膜滲透性提高，導致菌體因外環境水分滲入而膨脹裂解[26]。

2.4 免疫活性分析

2.4.1 增殖能力測定

巨噬細胞是機體中的一類免疫細胞，參與機體的特異性及非特異性免疫調節，起著中樞調節作用[27]。小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7通常作為研究人體免疫功能的體外模型[16]。本研究采用MTT法測定GRAE對RAW264.7細胞的增殖影響，結果如圖6所示。

由圖6所示，隨著GRAE作用濃度的增加，RAW264.7細胞的增殖能力呈現出先增加后減小的趨勢。當GRAE的作用濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，RAW264.7細胞增殖能力達最大值，其細胞活度分別為（138.1±5.9）%和（157.6±3.5）%。與 LPS陽性組[1 μg/mL，細胞活度為（128.6±3.2）%]相比，具有顯著性差異。這證明GRAE可以直接作用于巨噬細胞，使其增殖能力增強。當隨著GRAE的作用濃度進一步增加時，RAW264.7細胞的增殖能力反而減弱。其原因可能是高濃度的GRAE被細胞識別為一種外源性抗原，細胞出于自我保護機制而發生了一種高度有序的自我吞噬過程，進而造成細胞數量的減小[28]。

圖6 GRAE對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.6 The effects of GRAE on proliferation activity of RAW264.7 cell

2.4.2 吞噬能力測定

巨噬細胞不僅可以通過直接吞噬殺傷腫瘤細胞和病原體而發揮非特異性免疫調節作用；還可通過間接產生一些具有殺傷腫瘤細胞和免疫調節作用的細胞因子，激活免疫球蛋白或其他免疫細胞，進而在機體內發揮免疫調節功能[29]。細胞吞噬活性的增強，可以增強機體的免疫調節功能，使機體更有效的處理并呈遞抗原，也能更迅速地消滅內源或外源性病原菌[30]。因此，本試驗通過中性紅法探究了GRAE對RAW264.7細胞吞噬能力的影響，結果如圖7所示。

圖7 GRAE對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.7 The effects of GRAE on the phagocytic activity of RAW264.7 cell

由圖7可知，隨GRAE作用濃度的增大，RAW264.7細胞的吞噬能力呈現出先增強后減小的趨勢。當作用濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，細胞吞噬能力達最大值，A490值分別為0.898±0.049和0.926±0.035。該結果顯著高于空白組（A490為0.543±0.014）和LPS陽性組（A490值為 0.704±0.032），較空白組提高了約1.7倍。但當GRAE的作用濃度進一步增加至500 μg/mL～1 000 μg/mL 時，細胞的吞噬能力呈現下降趨勢。這可能由于細胞自噬機制而造成細胞數量的降低，進而導致細胞的吞噬能力也隨之下降[31]。

3 結論

本研究以將西蘭花副產物高附加值化為宗旨，以高效液相色譜法為檢測方法，以一種安全有效的方式提取西蘭花中的蘿卜硫苷。然后，通過冷凍干燥法制備蘿卜硫苷提取物，其中含有GRA、多糖、多酚、糖醛酸以及蛋白質等活性成分。抑菌試驗結果表明GRAE對大腸桿菌和沙門氏菌具有較強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用稍弱。體外免疫活性試驗結果顯示，GRAE對巨噬細胞株RAW264.7的增殖和吞噬能力均具有一定的促進作用。綜上，GRAE來源廣泛且具有一定的抑菌及體外免疫調節活性，具有較大的開發及工業化應用前景。