應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)分析柴胡-白芍藥對化學(xué)成分*

邢 威 ，陳雁雁 ，孟健男 ，張淑香 ，張洪財(cái)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.附屬第一醫(yī)院；b.藥學(xué)院；c.中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱150040）

藥對是中藥方劑的重要組成部分，是藥物與方劑之間的橋梁[1]。開展藥對研究能夠闡明中藥配伍規(guī)律及其作用機(jī)制[2]。柴胡、白芍是中醫(yī)內(nèi)科常用的藥物，也是經(jīng)典配伍藥對，始見《傷寒論》中治太少并病之柴胡桂枝湯；《景岳全書-新方八略》中的疏邪飲、柴葛煎以及柴胡飲均用柴胡、白芍藥對治外感表證。柴胡、白芍是疏肝解郁的配伍藥對，如《審視瑤函》之柴胡參術(shù)湯，《傷寒論》中四逆散、大柴胡湯，《太平惠民合劑局方》之逍遙散，《景岳全書》之柴胡疏肝散。柴胡白芍藥對因其疏肝解郁，調(diào)和氣血的功效，常用于抑郁癥、脅痛的治療[3,4]。單一成分的測定難以反映中藥飲片等的整體質(zhì)量，液相質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)在中藥復(fù)方的定性成分分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC/Q-TOF-MS 分析柴胡白芍藥對配伍前后化學(xué)成分整體的變化，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX-5600 型質(zhì)譜儀（美國AB 公司）；AcquityTMUPLC 型超高效液相（美國Waters 公司）；Acquity UPLC HSS T3 色譜柱 （1.8μm 2.1×100mm,美國Waters 公司）；FDU1200 凍干機(jī)（東京理化器械株式會社）；ME204T 分析天平（梅特勒-托利多精密儀器有限公司）；KDC-160HR 型高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）。

色譜級甲醇（規(guī)格:4L）、乙腈（規(guī)格:4L）、甲酸（規(guī)格:100mL）,均為北京 DIKMA 公司）；蒸餾水（批號2019-07-25 廣州屈臣氏食品有限公司）；柴胡（批號:181204）、白芍（批號:190115）藥材購于同仁堂藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫慧峰教授鑒定均為正品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備

柴胡-白芍共煎液的制備 將柴胡，白芍樣品粉碎，精密稱取 10g 后1∶1 混合后用水煎煮，3 次，每次1h，濃縮凍干，將凍干粉末2g 用甲醇溶解，5000r·min-1，離心10min，得供試品液。將供試品用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。

柴胡、白芍單煎液制備 制備方法與柴胡-白芍共煎液制備方法相同。

1.2.2 分析條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱 流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫程序見表1；體積流量 0.3mL·min-1；柱溫 40℃；進(jìn)樣量 2.0μL ；全波長掃描。

表1 液相洗脫程序Tab.1 Liquid phase elution procedure

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 采用全掃描質(zhì)譜和二級質(zhì)譜，質(zhì)譜掃描范圍 100～1500，離子源電壓為 5.5 和4.5kV，壓力為 3.792×105Pa，離子源溫度為 120℃，脫溶劑氣體溫度為500℃。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

1.2.3.1 數(shù)據(jù)庫的建立 借助于PubMed 和CNKI等數(shù)據(jù)庫檢索黃柏相關(guān)文獻(xiàn)，盡可能全面地建立黃柏所含化合物的分子式、分子質(zhì)量和化學(xué)名稱等信息數(shù)據(jù)庫，并借助于Chem Spider、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載各個化合物的mol 文件，計(jì)算其在正離子模式下常見離子[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+和負(fù)離子模式下常見離子 [2M-H]-、[M-H]-等多種離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比數(shù)值。

1.2.3.2 軟件應(yīng)用 通過分析比較各個化合物由總離子流圖提取到的一級質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)比對以及二級碎片與其mol 文件所對應(yīng)的碎片之間的匹配進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn)，最終質(zhì)量數(shù)誤差5×10-6以內(nèi)、結(jié)構(gòu)匹配度達(dá)到80%以上的成分被鑒定出來。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 柴胡-白芍藥對，柴胡、白芍單煎液化學(xué)成分鑒定

采用UPLC-Q-TOF-MS 進(jìn)行的正離子和負(fù)離子模式下的柴胡-白芍藥對、柴胡、白芍離子流圖見圖1。正負(fù)離子模式下鑒定出的化合物見表2。

通過對每個離子流峰分析，分析其質(zhì)譜裂解規(guī)律，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-14]，以及數(shù)據(jù)庫，識別化合物。共有化合物40 個，識別出白芍中15 個，柴胡中9個。

2.2 裂解分析

根據(jù)二級碎片離子信息和相關(guān)化合物的文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合自己建立的數(shù)據(jù)庫，以及在線的數(shù)據(jù)庫的檢索和篩選，確定了化合物類別。舉例說明鑒定結(jié)果及裂解規(guī)律：保留時間tR為2.13min，[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為 m/z169. 0762 ，脫去 1 分子 CO2形成 m/z 125.0795[M-H-CO2]-特征碎片，與文獻(xiàn)比對與沒食子酸裂解規(guī)律一致，故鑒定為沒食子酸；保留時間tR為18.44min，[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰為m/z779.2394丟失m/z167 中性碎片即丟失一個葡萄糖形成m/z617 離子碎片，m/z617 丟失 m/z146 形成 m/z417 離子碎片，即為m/z779 脫掉二糖形成。與文獻(xiàn)比對與柴胡皂苷b2 裂解規(guī)律一致，故鑒定為柴胡皂苷b2[5,10,11,14]。

圖1 柴胡,白芍單味藥及藥對總離子流圖Fig.1 Bupleuri Radix, Paeoniae Alba Radix single-drug and drug pair total ion chromatogram

表2 正離子模式下柴胡-白芍藥對水煎液化學(xué)成分分析Tab.2 Chemical constituents analysis of decoction of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pair in positive ion mode

表3 負(fù)離子模式下柴胡-白芍藥對水煎液化學(xué)成分分析Tab.3 Chemical constituents analysis of decoction of Bupleuri Radix-Paeoniae Alba Radix drug pair in negative ion mode

13.382 630.1321 629.3090 533.3205 牡丹皮苷B 白芍 C31H34O14 14.976 330.0734 329.3237 229.2227,211.2093 7,3'- 二甲氧基槲皮素 柴胡 C17H14O7 15.155 926.5233 971.6786 771.4928,617.4683 柴胡皂苷c 柴胡 C48H78O17 17.848 780.4654 825.6059 779.5969,617.5917,439.6205 柴胡皂苷a 柴胡 C42H68O13 18.446 780.4654 779.2394 617.2505,471.2214 柴胡皂苷b2 柴胡 C42H68O13 20.875 822.4760 867.6205 821.6095 2''-O- 乙酰化柴胡皂苷d 柴胡 C44H70O14 21.054 822.4760 867.2604 821.6085,617.6471 3''-O- 乙酰化柴胡皂苷d 柴胡 C44H70O14 21.730 780.4654 825.6061 779.5935,617.5505 柴胡皂苷d 柴胡 C42H68O13 22.334 822.4760 867.6113 821.6028,779.5898,617.5243 4''-O- 乙酰化柴胡皂苷d 柴胡 C44H70O14 23.265 910.6376 909.6351 677.5169,311.3067 未知 柴胡23.498 822.4760 867.6142 821.6065,779.5923,761.5797,617.5204 6''-O- 乙酰化柴胡皂苷d 柴胡 C44H70O14 24.747 565.4471 564.4442 504.4125,464.3791,265.2253 未知 柴胡24.946 465.3864 464.3801 267.3159,196.1117 未知 柴胡25.254 541.4451 540.4481 452.3788,339.2865,256.2246,116.9803 未知 柴胡

3 結(jié)論

UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)能夠準(zhǔn)確快速分析，具有高靈敏度、高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，解決中藥化學(xué)成分多樣性與復(fù)雜性的困難，使化學(xué)成分分析周期短，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，為中藥的開發(fā)提供優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)鑒定的柴胡-白芍藥對共40 個化合物，其中柴胡來源為9 個，白芍來源為15 個，未知成分16 個。

把藥對作為藥物配伍應(yīng)用的主要形式，可以反映復(fù)方配伍規(guī)律與內(nèi)在聯(lián)系。以此為研究切入點(diǎn)，研究配伍規(guī)律，可以揭示方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵，可拓展臨床用藥的思路。藥對在煎煮過程中發(fā)生復(fù)雜的物理和化學(xué)反應(yīng)，化學(xué)成分間的相互作用會使藥對的溶出功效物質(zhì)發(fā)生量變與質(zhì)變關(guān)系[12,13]，從而影響藥對整體物質(zhì)基礎(chǔ)變化。藥對與單味藥相對含量比較發(fā)現(xiàn)：柴胡皂苷a, c 含量降低，芍藥苷含量升高，說明兩者配伍增加芍藥苷溶出率，增強(qiáng)臨床療效。說明該藥對配伍具有科學(xué)性。下一步將對柴胡-白芍藥對水提物進(jìn)行大鼠體內(nèi)血清藥物化學(xué)，內(nèi)源性小分子成分變化，及體內(nèi)血中移行成分與內(nèi)源性成分的關(guān)聯(lián)性研究，全面闡明柴胡-白芍藥對配伍的科學(xué)內(nèi)涵。