BSA 熒光探針對醋氯芬酸含量的測定及相互作用的研究*

王艷妮，馬紅燕，王文山

（延安大學 化學與化工學院 陜西省反應工程重點實驗室，陜西 延安 716000）

醋氯芬酸（Aceclofenac，ACF）是目前常用的口服非甾體抗炎藥（NSAID）之一，具有顯著的抗炎、鎮痛作用，在治療術后疼痛，類風濕性關節炎和骨關節炎方面有明顯的療效[1]，與其他非甾體抗炎藥物相比，ACF 具有抗炎作用好、胃腸道不良反應發生率低等優點。為了保證ACF 在臨床上的安全性和有效性，避免長期服用導致含量過高而引起副反應，因此，建立一種快速、簡單的測定方法很重要。

目前，國內對ACF 含量的測定主要采用高效液相色譜法，隨著技術的成熟，電化學方法[2]、氣相色譜法[3]、紫外分光光度法[4,5]也相繼出現，但熒光法測定卻鮮少報道。牛血清白蛋白（BSA）是動物血漿中含量最豐富的功能蛋白，與人血清白蛋白（HSA）有高度的相似性和同源性，因此，常被用來研究藥物分子和血清蛋白的相互作用[6]。實驗發現ACF 對BSA的內源性熒光有線性猝滅作用，基于此，建立了測定ACF 的新方法。進一步探討了二者的作用機理，為后續研究ACF 在人體的運輸過程提供了數據參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

日本日立F-4500 熒光光度計；美國安捷倫8453紫外-可見分光光度計。

3.35×10-3g·mL-1BSA 標準溶液 準確稱取1.6750g 牛血清白蛋白標準品，超純水溶解定容至500mL 容量瓶；

3.5×10-4g·mL-1ACF 標準溶液 準確稱取0.0350g 醋氯芬酸標準品，用熱的超純水溶解后定容至100mL 容量瓶，使用時稀釋至所需濃度；

3.0×10-3mol·L-1HCl 溶液。

所用試劑均為分析純，配置好后于冰箱4℃保存，水為UP 超純水（實驗室自制）。

1.2 實驗方法

25℃下，于5 支25mL 比色管中分別加入4.00mL的HCl 溶液和1.00mL 的BSA 標準液，一份做試劑空白，其余比色管加入不同濃度梯度的ACF 溶液，每次增加濃度為2.8×10-7g·mL-1。充分搖勻后，室溫下靜置15min 進行測定。采用1cm 石英比色皿，激發狹縫和發射狹縫均為5.0nm，以283.0nm 為最佳激發波長，掃描300～450nm 范圍內的熒光發射光譜圖。以ACF 的濃度為0g·mL-1作為參照組，熒光強度記為F0，并計算ΔF。293K、310K 下測定與上述方法一致。

2 結果與討論

2.1 ACF 的測定

2.1.1 熒光光譜圖

由圖 1、2 可知，在 3.0×10-3mol·L-1的 HCl 溶液中，BSA 的最佳發射波長為338.0nm，較中性條件下藍移了6nm。而ACF 的加入使得BSA 338.0nm 處的熒光峰明顯降低，且隨著ACF 濃度的不斷增加，BSA 的熒光強度逐漸降低，說明ACF 和BSA 發生了結合反應從而誘導其內源性熒光猝滅。實驗發現ACF 在一定濃度范圍內與體系的ΔF 值呈良好的線性關系，因此，可用于ACF 含量的測定。

圖1 激發光譜Fig.1 Excitation spectrum

圖2 發射光譜Fig.2 Emission spectrum注:1-5cACF=0,1.4×10-7,4.2×10-7,7.0×10-7,9.8×10-7g·mL-1;cBSA=1.34×10-4g·mL-1

2.1.2 緩沖體系pH 值、種類及用量的選擇

固定BSA 和ACF 的測試濃度，研究了不同程度的緩沖液對BSA-ACF 體系的影響，結果見圖3。

圖3 pH 值對體系的影響Fig.3 Influence of pH on system

由圖 3 表明，pH 值在 3.30 左右體系的 ΔF 值最大。于此考察了同一pH 值下鄰苯二甲酸-HCl、檸檬酸-Na2HPO4、檸檬酸鈉-檸檬酸、B-R 等緩沖介質及3.0×10-3mol·L-1HCl 對 ΔF 的影響，結果表明在 3.0×10-3mol·L-1HCl 溶液中體系的 ΔF 值最大，且最佳用量為4.00mL。

2.1.3 BSA 用量的選擇

實驗研究了不同用量的BSA 對體系ΔF 值的影響，結果見圖4。

圖4 BSA 用量對ΔF 的影響Fig.4 Effect of BSA on ΔF

由圖 4 結果表明，當 BSA 用量在 0.5～2.0mL 時體系的ΔF 值最大且基本不變，但兼顧靈敏度和線性范圍考慮，本實驗選擇加入BSA 溶液1.00mL，最終測試濃度為 1.34×10-4g·mL-1。

2.1.4 增敏劑的選擇 為了提高檢測靈敏度，試驗了一系列的金屬離子和表面活性劑對ACF 的協同作用，例如 Cu2+，Ba2+，Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+、CTMAB、Tween-80、DTAB、β-CD、SDBS 等對體系的影響，結果表明，上述離子和表面活性劑均對BSA-ACF 體系的ΔF 值無明顯增敏作用，因此，本實驗不加入任何增敏劑。

2.1.5 穩定性的測定 按照實驗步驟配置好溶液、充分搖勻，每5min 測定一次熒光強度。結果表明靜置15min 后反應完全并且ΔF 值達到最大，且體系在10h 內無明顯波動情況，說明該體系比較穩定。

2.1.6 共存物質干擾 以相對誤差不高于±5%為限，研究了實驗過程中和實際樣品中可能存在物質的干擾情況。當 ACF 濃度為 4.2×10-7g·mL-1時，1000倍的 K+、Al3+、Ca2+、Zn2+、葡萄糖、果糖、蔗糖，500 倍的Cu2+、Mn2+，250 倍的 Mg2+，5 倍的 Fe3+不產生干擾。

2.1.7 精密度、檢出限及線性范圍的確定 在優化的條件下，ACF 溶液濃度在 1.4×10-8～0.99×10-6g·mL-1范圍內與體系的熒光強度ΔF 值呈良好的線性關系，線性回歸方程為 ΔF=3.0×108c（g·mL-1）+12.1，R2為 0.9925。對濃度為 2.8×10-7g·mL-1的 ACF 溶液平行測定5 次，其相對標準偏差為0.43%。根據IUPAC規定，以 3S0/S 計算，方法檢出限（S/N=3）為1.1×10-8g·mL-1。

2.1.8 樣品測定 隨機抽取同一批號的醋氯芬酸8片，準確稱取其質量，研細后稱取適量粉末，用超純水加熱溶解并超聲15min，最后定容至250mL 容量瓶中，搖勻，干過濾，棄去初濾液，移取一定量續濾液，按照實驗方法測定，并進行加標回收實驗，結果見表1。

表1 樣品測定及回收率實驗（n=5）Tab.1 Determination results of ACF in samples and recovery of the method（n=5）

2.2 作用機理的研究

2.2.1 猝滅方式的判斷 參考斯特恩-沃爾默方程：

式中 F、F0：有無猝滅劑時 BSA 的熒光強度；KSV：猝滅常數；Kq：雙分子猝滅過程速率常數；[Q]：猝滅劑的濃度；τ0：無猝滅劑時生物大分子的平均壽命。

測定不同ACF 濃度下的F0/F 值，以F0/F 對[Q]作圖得出：293K 下，方程為 y=1.18×105x+0.963，r=0.9913；310K 下，方程為 y=1.40×105x+0.960，r=0.9991；根據方程得到的猝滅常數KSV由1.18×105逐漸增加至1.40×105L·mol-1，說明二者反應形成了復合物且猝滅方式為動態猝滅。但Kq的數量級為1013，猝滅方式似乎為靜態猝滅，考慮到離子強度是影響KSV的主要因素[8]，因此Kq的增大有可能是離子強度影響的結果，所以初步認為ACF-BSA 體系的猝滅過程為動態猝滅。

2.2.2 結合常數和結合位點數的計算 由lg [（F0-F）/F]= lgKA+nlg[Q]可求出表觀結合常數KA和結合位點數n：

以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖，擬合出不同ACF 濃度下的雙對數曲線：293K 下，方程為y=1.064x+5.36，r=0.9977；310K 下，方程為 y=1.134x+5.84，r=0.9980；可以看出，ACF 和BSA 的結合位點數分別為1.06和1.13，總體接近于1，表明ACF 在BSA 上只有一個結合位點。通過計算得出KA分別為2.29×105和6.92×105L·mol-1，數量級均達到 105，隨著溫度的升高逐漸增大，揭示了二者的結合力不斷增強，即ACF能夠很好的與蛋白質發生結合，從而在體內起到運輸和儲存的作用。

2.2.3 作用力的判斷 有機小分子和蛋白質大分子發生反應主要通過各種作用力相結合，類型有：疏水作用力（ΔH＞0，ΔS＞0），氫鍵和范德華力（ΔH＜0，ΔS＜0），靜電引力（ΔH＜0，ΔS＞0），參考范特霍夫方程[9]：

計算出ACF 和BSA 之間的熱力學參數，見表2。

表2 ACF-BSA 的猝滅常數、結合常數，結合位點數和熱力學參數Tab.2 Quenching constants, binding constants, binding sites and thermodynamics parameters of BSA-ACF

ΔH＞0，ΔS＞0 說明二者通過疏水作用力相結合，即ACF 進入到BSA 的疏水腔內部是通過疏水作用力完成的，ΔH＞0，ΔG＜0 說明該反應放熱、自發正向進行[10]。

2.2.4 結合位置的確定 由表2 可知ACF 和BSA反應形成復合物時存在一個結合位點，而在BSA 的疏水亞結構域中，含有兩個能和藥物分子結合的位點（ⅡA 和ⅢA）。ⅡA 位點同時含有 Trp 和 Tyr 兩種氨基酸殘基，而ⅢA 只含有Tyr 一種發熒光的殘基。當激發波長為283nm 時，可同時激發BSA 的Trp 和Tyr 殘基的熒光，當激發波長為295nm 時，僅激發Tyr 殘基的熒光[11]。因此，欲探究ACF 和BSA 發生反應時兩種氨基酸的參與情況及二者具體的結合位置，本實驗對比了不同激發波長下（283nm 和295nm）ACF 對BSA 的熒光猝滅程度，計算出不同濃度下的F/F0值。

圖5 ACF 與BSA 作用的相對熒光猝滅曲線Fig.5 Fluorescence quenching curves of ACF-BSA

由圖5 可知，當激發波長分別為283 和295nm時，ACF 和BSA 的相對猝滅曲線沒有發生重疊，且以283nm 為激發波長的熒光猝滅程度比295 nm 激發的猝滅程度大，表明兩種氨基酸殘基均參與了猝滅過程，也進一步確定ACF 主要和BSA 的ⅡA 位點發生結合。

2.2.5 紫外吸收光譜 靜態猝滅是藥物分子與BSA在基態生成了不發光的配合物，從而引起BSA 的紫外吸收光譜的變化，而動態猝滅不影響紫外吸收光譜的變化。實驗于8453 型紫外-可見分光光度計上分別測定BSA 及BSA-ACF 的紫外吸收光譜圖，發現最大吸收波長和峰型均沒有發生變化。進一步揭示了ACF 和BSA 的猝滅過程為動態猝滅。

2.2.6 同步熒光分析 同步熒光法可以探究ACF對BSA 的Trp 殘基和Tyr 殘基的影響，因此，同步熒光光譜也可以作為判斷結合位點的手段。Δλ=15nm時為Tyr 殘基的光譜特征，Δλ=60nm 時為Trp 殘基的光譜特征。

圖6 BSA-ACF 的同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BSA-ACF system

由圖6 可知，隨著ACF 濃度的增大，Trp 和Tyr殘基的熒光強度均逐漸降低，但峰位置沒有發生明顯變化，表明兩種氨基酸殘基均參加了結合反應，與位點判斷實驗相互印證。相比較體系在Δλ=60nm 的猝滅程度比Δλ=15nm 的猝滅程度大，證明Trp 對BSA 的熒光猝滅貢獻大于Tyr 殘基，即ACF 主要與BSA 的 Trp 殘基結合。

3 結論

在酸性條件下，利用熒光光譜法測定出不同濃度ACF 對BSA 熒光強度的影響，提出了定量測定ACF 的熒光新方法。溫度影響的研究表明，ACF 以動態方式猝滅了BSA 的熒光，結合常數為105數量級，即二者有很強的相互作用；熱力學參數表明二者主要靠疏水作用力自發結合形成復合物；同步熒光法和位點實驗證明只有一個結合位點，且主要位于BSA 的ⅡA 亞結構域中。該研究為進一步了解ACF在體內的儲存、運輸提供了數據參考，為測定ACF含量提供了新方法。