HPLC 法測定維生素B1 注射液中維生素B1 含量

陸春波 林仙軍 阮鑫 陳曉林

(浙江省獸藥飼料監察所 311099)

維生素B1屬于水溶性B 族維生素，在動物體內與焦磷酸結合成二磷酸硫胺，參與體內糖代謝中丙酮酸、α-酮戊二酸的氧化脫羧反應，為糖類代謝所必須。維生素B1對維持神經組織、心臟及消化系統的正常機能起重要作用。臨床上維生素B1注射液用于防治維生素B1缺乏癥，如多發性神經炎、運動失調、抽搐等，也用于胃腸弛緩，還可用于高熱、重度損傷以及牛酮血癥、心肌炎的輔助治療[1]。維生素B1注射液屬于人獸共用品種，在收集獸用維生素B1注射液樣品時發現，養殖場和寵物醫院采用人用維生素B1注射液的現象普遍，究其原因，一是人用藥品比獸用藥品價格低廉；二是獸用維生素B1注射液的生產企業相對較少，進貨及時性很難保證。建議農業農村行政主管部門加強對養殖場和寵物醫院用藥的監督檢查，禁止將人用藥品用于動物，以規范獸藥使用。

維生素B1注射液含量測定方法主要有紫外-可見分光光度法[2]、液相色譜法[3,4]、漫反射紅外光譜法[5]等。該產品收載于《中國獸藥典》 2015 年版一部，采用高效液相色譜法檢測有關物質，但采用紫外-可見分光光度法對維生素B1含量進行測定。本文建立了HPLC 法測定維生素B1注射液中維生素B1含量的方法，對方法進行驗證，并比較了紫外-可見分光光度法和本法的結果差異。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters 2695 高效液相色譜儀，配Waters 2487 檢測器，美國Waters 公司；XS-205 電子天平（感量0.01mg），瑞士METTLER TOLEDO 公司；FE 20 型pH 計，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；維生素B1對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號100390-201806，含量97.9%；甲醇、乙腈為色譜純，Merck KGaA 公司；庚烷磺酸鈉為液相色譜專用試劑；其余試劑均為分析純；實驗用水為milli-Q 超純水；維生素B1注射液產品4 批次，批號為20181102，規格2ml:0.1g，由山西某企業生產；批號為20180707，規格10ml:0.25g，由四川某企業生產；批號為180401，規格2ml:0.1g，由福建某企業生產；批號為18070102，規格10ml:0.25g，由山西某企業生產。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry RP18 （5μm，4.6mm×250mm）；流動相：甲醇-乙腈-0.02mol/L 庚烷磺酸鈉溶液（含1%三乙胺，用磷酸調節pH 值至5.5）（7:7:84，v/v）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：246nm；進樣量：20μl。在此色譜條件下，理論板數按維生素B1峰計算為8318 （大于2000），對照品溶液、供試品溶液的色譜圖見圖1，溶劑無干擾。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取維生素B1對照品約25mg，置25ml 棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為對照品貯備液（1mg/ml）。精密量取5ml，置100ml 棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，為對照品溶液（50μg/ml）。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密量取維生素B1注射液1ml （2ml:0.1g）或2ml （10ml:0.25g），置50ml 棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度。精密量取5ml，置100ml 棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，為供試品溶液（50μg/ml）。

2 結果與分析

2.1 線性關系

精密量取對照品貯備液（1mg/ml）適量，置棕色量瓶中，用流動相稀釋成1、10、20、50、100、200μg/ml 的系列對照品溶液，按上述色譜條件，精密吸取20μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（μg/ml）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程為：Y=27464X+3039 （R2=1.0000）。結果表明維生素B1的進樣濃度在1～200μg/ml 范圍內線性關系良好。

2.2 精密度

精密量取50μg/ml 的對照品溶液20μl，按上述色譜條件，連續進樣6 次，記錄色譜圖，維生素B1峰面積的RSD 為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復性

取供試品（批號18070102），照1.2.3 項下方法制備供試品溶液6 份，測定供試品溶液中維生素B1的含量。結果測得維生素B1 含量的RSD 為0.5%，表明方法有較好的重復性。

2.4 穩定性

取同一供試品溶液（批號18070102），分別于0、1、2、4、6、8、12h 各精密吸取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果維生素B1峰面積的RSD 為0.4%。結果表明，供試品溶液在室溫下12h 內穩定性良好。

2.5 準確度

精密量取已知含量的維生素B1注射液（批號18070102，規格10ml:0.25g，含量為占標示量102.3%）1.00ml，共9 份，置100ml 棕色量瓶中，按H （120%）、M （100%）和L （80%）3 個濃度水平分別添加維生素B1對照品，制得向已知含量制劑中添加已知測定物的添加樣品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3 份供試樣，用流動相溶解并稀釋至刻度；精密量取5ml，置50ml 棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度。按1.2.1 方法測定并計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果表（n=9）

2.6 耐用性

在優化的色譜條件下比較了Waters Symmetry RP18（5μm，4.6mm × 250mm）、Welch Ultimate AQ-C18 （5μm，4.6mm × 250mm）和Agilent Eclipse XDB C18 （5μm，4.6mm ×250mm）色譜柱，結果表明，3 者均能使峰形尖銳；對柱溫進行了研究，在本文優化的流動相下選擇溫度為25、30 和35℃時，除出峰時間發生變化外，其余變化很小；將流動相甲醇、乙腈和庚烷磺酸鈉溶液比例調為6:6:88、7:7:86 和8:8:84 進行測試，結果表明，流動相比例微調也僅能影響出峰時間；將流動相的pH 調為5.3、5.5、5.7，結果表明，流動相pH 的微調對峰形和理論塔板數影響甚小。綜上所述，不同品牌的色譜柱、不同流動相有機相與水相比例、不同pH、不同柱溫均能滿足試驗需要，方法耐用性較強。

2.7 實際樣品測定

取維生素B1注射液，按1.2.3 項下方法處理，按上述色譜條件進行測定，每個樣品制備2 份，計算樣品中維生素B1 的含量，取平均值。同時與《中國獸藥典》 2015 年版一部紫外-可見分光光度法比較，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（標示量/%，n=2）

3 討論

3.1 色譜條件和檢測波長的選擇

參考《中國獸藥典》 2015 年版一部，維生素B1有關物質項中的流動相組成，但適當調整流動相比例，使得維生素B1保留時間適中。經試驗驗證，此流動相峰形較好，柱效較高。在檢測波長選擇上，維生素B1在246nm 有最大吸收（見圖2），因此本試驗采用246nm 作為檢測波長。

圖2 維生素B1 對照品溶液的紫外吸收光譜圖

3.2 實際樣品測定分析

從圖2 可知，批號為20180707 的維生素B1注射液，采用液相色譜法與紫外-可見分光光度法兩種方法的測定結果差異顯著，紫外-可見分光光度法檢測結果為占標示量的100.5%，但液相色譜方法測定僅占標示量的64.0%，分析原因為維生素B1注射液在生產和貯藏過程中容易降解[6]，維生素B1降解產物也有紫外吸收而導致。用《中國獸藥典》 2015 年版一部規定的方法測定有關物質，結果顯示，該批次樣品有關物質為38%，其余3 批次樣品有關物質均小于2%。因此，采用高效液相色譜法同時測定含量與有關物質具有很好的相關性。

本文采用高效液相法測定維生素B1注射液中維生素B1含量，該方法與紫外-可見分光光度法進行比較，具有更強的專屬性，對本產品質量控制具有重要意義。