大蒜素的提取及抑菌效果研究

劉麗珍，甄莉娜，崔乃忠，白志強

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學應用生物技術研究所，山西 大同 037009)

大蒜是百合科蔥屬植物蒜的鱗莖部分[1]，作為食藥同源植物富含營養物質和必需氨基酸，被人們廣泛使用[2]。紫皮大蒜為富硒農產品，具有殺菌抗菌、抗癌抗突變、增加生物活性、減少心腦血管疾病、調節機體免疫能力等功效，被譽為“天然抗生素”[3-5]?！侗静菥V目》中記載，大蒜可以祛風濕、除風邪、止衄血、通五臟、治泄瀉、止霍亂及散癰腫[6-7]。新鮮的大蒜不含生物活性物質大蒜素，以不穩定的蒜氨酸形式存在[8]。王希麗等[9]研究表明，白皮蒜有26種揮發性成分，而紫皮蒜有35種。大蒜被搗碎后，蒜氨酸經蒜氨酸酶的催化生成了大蒜素[10]。侯志敏等[11]研究表明，紫皮大蒜的大蒜素含量高，抑菌作用明顯，而且對細菌病毒均有殺滅和抑制作用[12]。

目前，大蒜素的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑法、真空微波萃取法和超臨界萃取法。水蒸氣蒸餾法設備簡易、方便操作、穩定性好、成本低，但高溫會使蒜酶失活，導致大蒜素的產率降低[13]；有機溶劑法提取設備簡易，操作方法簡便，大蒜素提取產率較高，廣泛用于食品藥品領域[14]；真空微波萃取法操作簡單，提取率高，但高溫易使大蒜素分解；超臨界萃取法安全可靠，提取大蒜素的產率非常高，不易破壞原產物，但成本高、不易操作，用于制備高附加值的食品。本試驗以山西應縣紫皮蒜為材料，采用有機溶劑法提取大蒜素，結合單因素試驗和正交試驗選出最佳提取條件；之后將較常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種到含有大蒜素的培養基中，以探討大蒜素對兩種細菌的作用，為食品藥品和醫學方面的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

紫皮大蒜：應縣產；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：由山西大同大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器

JA5003B型分析天平 上海精科天美科學儀器有限公司；A-88型組織搗碎機、GZX-250-D型光照培養箱、DK-8D型數顯恒溫水浴鍋 金壇國旺實驗儀器廠；HC-2062型臺式高速離心機 安徽中科中佳科學儀器公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；9070MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大蒜的選取及提取工藝

選取大小均勻、瓣肉潔白、無病蟲害、無機械破損的紫皮大蒜。去皮后用無菌水清洗干凈，搗碎成泥狀，40 ℃酶解30 min，離心15 min，取上清液過濾、除菌、分裝于高壓滅菌后的離心管中備用。

1.3.1.1 料液比對大蒜素提取的影響

準確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入95%的乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，設置料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，離心取上清液，每個樣品重復3次，觀察不同料液比下大蒜素的提取率。

1.3.1.2 乙醇濃度對大蒜素提取的影響

準確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入不同濃度的乙醇溶液20 mL，40 ℃水浴1 h，設置乙醇濃度分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%，離心取上清液，每個樣品重復3次，觀察不同乙醇濃度下大蒜素的提取率。

1.3.1.3 提取溫度對大蒜素提取的影響

準確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，水浴1 h，設置溫度分別為20，25，30，35，40，45 ℃，離心取上清液，每個樣品重復3次，觀察不同提取溫度下大蒜素的提取率。

1.3.1.4 提取時間對大蒜素提取的影響

準確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，30 ℃分別水浴0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，離心取上清液，每個樣品做3次重復，觀察不同提取時間下大蒜素的提取率。

1.3.2 制備菌懸液

采用牛肉膏蛋白胨培養基接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，置于37 ℃培養箱24 h，分別置于0.9%的生理鹽水中制成菌懸液進行試驗。

1.3.3 測定抑菌能力

將打孔滅菌處理過的濾紙片置于大蒜提取液中,浸泡50 min。放入含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平板里，待菌液全部吸收入培養基內，于恒溫培養箱37 ℃培養24 h觀察抑菌圈直徑，每種菌重復3次取平均值。

1.3.4 測定最小抑菌濃度(MIC)

用無菌蒸餾水2倍稀釋大蒜素原液，濃度為500，250，125，62.5，31.25，15.625 mg/mL 6個不同梯度，分別浸泡濾紙片到含有1.3.3菌的培養基中，每種重復3次。

1.4 正交試驗

在料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間 4個單因素中，分別選取3個影響最大的因素為水平，做 L9(34)正交試驗，重復3次，以考察大蒜素的最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 因素試驗結果

2.1.1 料液比對大蒜素提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的加大，大蒜素的提取率逐漸增加，當料液比為1∶4時，提取率為最大值，繼續添加乙醇量，大蒜素的提取率反而開始下降。因此在做正交試驗時，選取料液比1∶3、1∶4、1∶5做3個水平。

圖1 料液比對大蒜素提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of allicin

2.1.2 乙醇濃度對大蒜素提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，大蒜素的提取率不斷增加，并且在濃度為85%時達到最大值，當濃度大于85%時，大蒜素的提取率開始下降。可能是因為濃度較低時，大蒜素未被乙醇完全萃取，而影響大蒜素向有機相轉移，溶劑體積分數增大，有利于大蒜素的提取，達到飽和時，大蒜素不穩定，開始分解。因此在做正交試驗時，選取乙醇濃度75%、85%、95%做3個水平。

圖2 乙醇濃度對大蒜素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of allicin

2.1.3 提取溫度對大蒜素提取率的影響

由圖3可知，大蒜素的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加，在溫度為35 ℃時，大蒜素的提取率最高；隨著溫度的繼續上升，大蒜素的提取率呈下降趨勢。可能是由于低溫時，蒜氨酸酶的活性較低，影響大蒜素向有機相的轉移；溫度繼續上升加快了分子的熱運動，酶的活性也達到最大，提取率最高；但過高的溫度會導致大蒜素不穩定而分解，逐漸轉化成其他物質，而使大蒜素的含量減少。即蒜氨酸酶的活性隨著溫度的升高而增強，達到一定程度時，活性趨于平穩，之后溫度繼續升高，酶的活性反而下降直到失活狀態。因此在做正交試驗時，選取提取溫度30，35，40 ℃做3個水平。

圖3 提取溫度對大蒜素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of allicin

2.1.4 提取時間對大蒜素提取率的影響

由圖4可知，大蒜素的提取率隨著提取時間的延長不斷增加，時間為1.5 h時，大蒜素的提取率達到峰值，之后大蒜素的提取率不隨時間的延長而增加，反而下降。原因可能是開始時提取時間較短，蒜氨酸不能完全分解為大蒜素；但時間過長時，已生成的大蒜素或已揮發或已轉化成其他物質。因此在做正交試驗時，選取提取時間1，1.5，2 h做3個水平。

圖4 提取時間對大蒜素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of allicin

2.2 正交試驗結果

綜合單因素試驗結果，以料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間為考察因素，以大蒜素提取率為指標，做4因素3水平正交試驗，重復3次，結果見表1。

由表1～表3可知，提取大蒜素的最佳條件為A3B2C3D2，即料液比為1∶5，乙醇濃度為85%，提取溫度為40 ℃，提取時間為1.5 h時，大蒜素的提取率最大。由極差值R可知，有機溶劑提取法提取紫皮大蒜中大蒜素的影響順序為A>B>D>C，即料液比的影響最大，乙醇濃度的影響次之，提取溫度的影響最小。4個因素對大蒜素的提取率影響不顯著。用優化的組合重復3 次做驗證試驗，得出的提取率為0.43%。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of L9(34) orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

2.3 大蒜素的抑菌結果

大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌結果見表4和表5。

表4 大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 4 The bacteriostatic zone diameter of of Escherichia coli

表5 金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Table 5 The bacteriostatic zone diameter of Staphylococcus aureus

由表4和表5可知，紫皮大蒜中大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，且抑菌圈直徑隨著大蒜素濃度的增加而增大。這可能是由于大蒜素中的含硫活性基團與細菌生長所必需的半胱氨酸中的巰基結合，競爭性地抑制了細菌生長繁殖[15]。Fujisawa H等[16]認為，大蒜素的抗菌能力是其釋放的氧原子或烯丙基巰基與細菌中的巰基酶相互作用的結果。

2.4 最小抑菌濃度

由表6可知，大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為62.5，31.25 mg/mL，且大蒜素對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯強于大腸桿菌，這與姚芹等[17]、尚叢珊等[18]的研究結果一致，且抑菌效果隨濃度的增大而增加。

表6 大蒜素的最小抑菌濃度Table 6 The minimum inhibitory concentration of allicin

3 結論

根據單因素試驗和正交試驗結果得出：當乙醇濃度為85%，料液比為1∶5，提取溫度為40 ℃，提取時間為1.5 h時，大蒜素的提取率最大，為0.43%。大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度分別為 62.5，31.25 mg/mL，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌，該試驗結果為大蒜素的進一步研究提供了理論基礎。