魚露發酵技術及風味研究進展

白妞妞，白鍇凱，何建林，洪碧紅*，張怡

(1.福建農林大學 食品科學學院，福州 350002；2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，福建 廈門 361005)

魚露是一種類似于醬油的調味料，外表呈褐色液體，風味獨特，不同的原料和發酵過程產生了不同氣味和顏色的產品。我國很多地區均有魚露生產，福建省以其優越的地理條件盛產魚露，銷售到各個國家。在泰國，魚露是最受歡迎的醬料，幾乎每個家庭都用它作為調味品或烹飪調味料。在湯、鹵汁和餃子中加入魚露不僅能夠增加風味，還能增加煙熏味，豐富度等。因此魚露在全球范圍內也越來越被人們所接受，成為我國沿海地區、東南亞和日本居民的主要膳食調味料之一。

1 魚露發酵技術

1.1 魚露傳統發酵技術及存在問題

在過去的幾十年里，我國漁業一直在持續增長，并產生了大量的副產品，這些副產品來自魚頭、魚皮、魚骨、魚刺和內臟。其中一部分被加工成飼料、膠原蛋白、生物燃料和化肥，但許多其他高價值的生物活性化合物未加以回收利用[1]。傳統魚露是利用低值魚(藍圓鲹、沙丁魚、巴浪魚)、蝦或者工業下腳料魚頭、魚肝或魚內臟為原料，加入30%～40%的鹽，放置在太陽底下暴曬，發酵1年左右而制成的魚醬油制品[2]。每年的農歷2月和8月是制作魚露的最佳時間，這個時候空氣中水分少，鹽分和魚肉及菌類能夠在時間的流逝中慢慢融合，自然發酵，并逐漸在酶的作用下分解出營養價值極高，富含蛋白質和氨基酸，此外還有牛磺酸、有機酸和微量元素的魚露。但是，由于不同地方生產的魚露品質不同，有的重金屬如鉛、鎘、砷等超標，有的甚至因生物胺超標而引起腥臭味等，對魚露的品質造成極大的影響。姜華軍等[3]采用微波消解結合電感耦合等離子體發射光譜法(CP-OES)測定了魚露樣品中的元素成分，結果顯示，魚露樣品中含有13種金屬元素，且大多為鉛、鎘、砷、鎳等重金屬元素。

傳統發酵魚露具有良好風味的同時也產生了一系列問題：第一，傳統魚露發酵周期長，一般要發酵2～3年，產量低下；第二，由于傳統發酵技術在發酵過程中不添加任何酶類，發酵過程不定向從而導致魚露營養不夠全面；第三，魚露在自然發酵過程中由于微生物或酶的作用會發生一系列生化反應從而產生具有不良風味的代謝產物，這些化合物給魚露帶來獨特的腥味、汗味、酸味等，嚴重限制了它的可接受性。因此，尋找改善魚露風味的方法對食品工業具有重大意義。

1.2 魚露快速發酵新技術

針對傳統魚露發酵存在周期長、不定向等問題，近年來很多科研工作者研究了魚露快速發酵新技術，其目的是為了保持魚露在短時間內完成發酵的基礎之上，還能夠保持魚露的獨特風味[4]。

保溫發酵技術是指將溫度維持到適宜魚體水解的最適溫度，利用魚體內的內源性酶將蛋白質、脂肪、糖類等大分子物質水解為氨基酸、單糖、酯類和醇類等小分子物質，從而提高魚露營養價值和風味物質的一種發酵技術。國內外學者研究了魚蛋白在恒溫條件下的水解情況，發現在恒溫條件下能夠加快魚蛋白的水解速率，并將此方法應用到魚露發酵過程中，在鯖魚中添加水產品加工廢棄物，并保持溫度30 ℃或光照條件下進行發酵，最終測定游離氨基酸組成與商品中氨基酸組成成分不同，但在氣味、味道等方面均能被消費者接受。該方法有效利用水產品加工廢棄物，縮短了魚露的發酵周期。

1.2.2 外加酶發酵技術

外加酶發酵技術是在魚蛋白自溶過程中，引入適量的外源酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等加速魚露發酵或改善魚露風味的一種發酵新技術。發酵魚產品在東南亞國家非常受歡迎，這些產品具有獨特的特性，尤其是在發酵過程中產生的香氣、風味和紋理。而蛋白水解酶對形成這些香氣、風味和紋理起至關重要的作用。Gao Ruichang等[5]對嗜鹽古菌產的一種胞外蛋白酶進行了純化和表征研究。質譜分析表明該蛋白酶與鹽鹵菌蛋白酶具有某些共同的功能特征，是一種具有耐堿性和耐鹽性的酶，能高效水解鰱魚肌球蛋白，這些優良的特性使該蛋白酶成為工業生產低鹽魚露發酵的理想原料。Zeng Xuefeng等[6]在中國傳統的低鹽發酵全魚產品“酸魚”中分離得到27株木糖葡萄球菌，分離物被證明對肌動纖毛蛋白和肌漿蛋白有適當的蛋白水解活性，且具有耐低溫、耐鹽和抑菌功能。將其接種到魚糜培養基上發酵72 h，發現魚糜中游離氨基酸含量有了顯著的提高，風味也得到了改善。

1.2.3 微生物發酵技術

微生物發酵技術是在魚露的自然發酵過程中，通過引入適量產蛋白酶、淀粉酶等外源酶來源的微生物，如加入產蛋白酶的芽孢桿菌或米曲酶等，加速魚蛋白或其他大分子物質的分解，從而縮短魚露發酵時間或增強魚露風味的一種發酵新技術。Zhao Jiuxiang等[7]以黑曲霉、米曲霉(FSB，Aspergillusoryzaekoji∶Aspergillusnigerkoji為3∶1)和米曲霉(FSA，Aspergillusoryzaekoji)接種淡水魚露，發酵結束后，FSB發酵魚露的氨基酸、總可溶性氮、游離氨基酸(FAA)和谷氨酸的含量較FSA分別增加7.50%、7.84%、9.80%和28.43%。結果表明，采用混合霉菌發酵方法生產魚露是一種有效的方法，可以加速發酵過程，改善淡水魚露的風味。Ohshima等[8]用16S rRNA新一代測序法檢測了泰國魚露在發酵不同階段的細菌菌群特征，發現發酵罐中的原料來源和細菌菌群影響了整個發酵過程中存在的細菌種類，從而影響了產品的獨特特性。

2 魚露的風味物質研究

2.1 魚露的風味

魚露作為日本和東南亞地區人們最常見的調味品，之所以能夠延續至今，是由于它獨特的鮮味和香味備受人們的喜愛。但是，僅僅由于這些簡單呈味物質的組合并不能供給足夠的風味，必須要通過水產原料發酵形成的復雜體系共同作用，才能形成具有獨特風味的魚露。Kim等[9]從亞洲國家購買5種不同的傳統醬料(美居醬油、釀造醬油、魚醬油、石魚醬油和鳳尾魚醬油)腌制豬肉樣本，4周后，鳳尾魚醬油腌制豬肉中愉快味道化合物的數量顯著高于其他醬油腌制樣本，同時，與其他醬料相比，鳳尾魚醬油的腌制在一定程度上增加了肉制品中的風味化合物成分。

該文從構造特征、沉積體發育規模、儲層孔隙度下限等地質特征入手，分析該油田的不確定性因素，并確定其分布范圍，以地質模型為載體，分析其對儲量的影響，開展不確定性分析，確定儲量分布的P10，P50，P90(一個油田的儲量分布符合正態分布，P50指最可能出現的值，出現概率最大，也叫推薦值；P10和P90出現概率較小，P10代表儲量低值也叫悲觀值，P90代表儲量高值也叫樂觀值)。

2.1.1 魚露的鮮味

魚露中含有17～18種氨基酸，不同的氨基酸對魚露的鮮味有不同的貢獻作用，最終形成了口味獨特的魚露。Yung等[10]曾研究了發酵魚露對泡菜發酵的影響，利用核磁共振氫譜(1H NMR)對泡菜的代謝產物進行分析，結果表明，含有發酵魚露的泡菜中氨基酸和-氨基丁酸(GABA)含量較高，醋酸鹽、乳酸鹽和甘露醇含量也增加得較快，可見魚露可作為良好的鮮味劑。此外，為了提高魚露的鮮味，許多研究者試著采用將產谷氨酰酶活力高的菌種接種到魚露中的方法來代替直接加谷氨酰酶或醬油曲。目前，日本的一些研究者已經利用此方法篩選出了一株產谷氨酰酶活力高的耐鹽性枯草芽孢桿菌并應用于魚露的發酵過程中。魚露鮮味主要來源物質的特點及作用見表1。

表1 魚露鮮味主要來源物質的特點及作用Table 1 The characteristics and functions of main source substances of fish sauce umami

2.1.2 魚露的香味

魚露的香味由酯類和醇類物質組成。其香味來源有：原料魚自溶生成，曲霉發酵產物生成以及原料魚在發酵過程中微生物如乳酸菌和酵母菌經過一系列復雜的生化反應產生的代謝產物。Mohamed等[11]采用DB-WAX和HP-5MS雙色譜柱分析了馬來西亞魚露中的揮發性成分，檢測到了44種揮發物質，其中3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、二甲基二硫、3-(甲基硫)-丙醛、3-甲基丁酸和苯并乙醚由于其較低的閾值而被認為是具有芳香活性的化合物。

2.2 魚露發酵過程及風味物質形成機理

2.2.1 魚露的發酵過程

魚露發酵過程主要經歷3個階段：第一階段為成分降解即液化階段，第二階段是營養物質的產生及形成階段即代謝產物形成階段，第三階段即為產物再平衡階段。不同階段的酶在發酵不同階段有不同的作用。發酵前期的酶是依靠微生物代謝產生的，在這些酶的作用下分解大分子物質，即蛋白質變性，可溶性蛋白和糖在此階段溶出，此類物質為后期酵母菌和乳酸菌的生長提供了營養。淀粉在酶的作用下產生的多糖類與氨基酸進行美拉德反應，產生棕色色素。發酵后期，乳酸菌和酵母菌共同作用，在各類酶的催化作用下，形成一系列風味成分。魚露在發酵過程中離不開各種酶的水解作用，這些酶的主要來源可分為兩種：一種是由魚體本身存在的酶對自身魚蛋白的酶解作用，稱為內源酶；另一種是為了加速發酵過程、改善風味而人為添加的一類酶，可以從微生物中分離得到，也可以在市場購買，這類酶活力高、定向性好。

2.2.2 魚露風味物質形成機理

魚露發酵過程經過一系列生化反應而形成揮發性風味物質，其主要生化反應包括美拉德反應、脂肪氧化、Strecker降解、微生物代謝等。目前通過在魚露中添加微生物或幾種復合微生物來改善魚露的風味已成為研究魚露的主要方向。魚露中風味物質形成的主要途徑見圖1。

圖1 魚露中風味物質形成的主要途徑Fig.1 The main ways of the formation of flavor substances in fish sauce

有研究表明，魚露中的葡萄球菌(Staphylococcussp. CMC5-3-1)通過代謝2-甲基丙醛增強了魚露的特征香氣，奧默柯達酵母(KodamaeaohmeriM8)的代謝物增強了魚露的奶酪香味、肉香味。枝芽孢桿菌屬(Virgibacillussp. SK37)的代謝物使魚露產生了獨特的麥芽香和黑巧克力香。米曲霉(AspergillusoryzaeOAY1)的代謝物2-甲基丁醛、戊醛、己醛、苯甲醛等揮發性物質的產生使得魚露發酵3 d即可達傳統魚露香氣。而木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)的代謝物的產生不僅消減魚腥味、鐵銹腥味、酸敗味，還可以降低一些對人體有害物質的含量。

3 微生物對魚露的影響

魚露發酵的速度和最終形成的風味都與其發酵過程中的微生物密不可分。Du Fangming等[12]首次利用高通量測序技術揭示了中國傳統魚露(traditional Chinese fish sauce，TCFS)發酵過程中細菌群落的動態變化。在TCFS發酵的早期階段，變形桿菌內的Shewanella希瓦氏菌屬(約90%)是優勢菌群。到第12個月，厚壁菌門內的halan厭氧菌(3%～86%)迅速取代希瓦氏菌成為優勢屬。在發酵后的第3個月和第9個月檢測到大量屬于厚壁菌門的乳球菌(3.31%)和芽孢桿菌(45.56%)。在后期(12～15個月)，厚壁菌門內的四聯球菌取代厭氧菌屬成為最主要的細菌(29.54%)。采用偏最小二乘回歸(PLSR)方法，研究了氨基酸、游離氨基酸、總可溶性氮、三甲胺(TMA)等主要功能物質與細菌群落的關系。四聯球菌與TMA的形成呈正相關，而鹵菌屬則相反，表明四聯球菌可能是一種很好的TCFS發酵劑。王炳華等[13]也利用高通量測序并結合熒光定量PCR法分析了鳀魚魚露發酵過程中微生物菌群情況，發現厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門等是鳀魚在發酵過程中產生的主要微生物菌群。這些結果有助于我們了解TCFS發酵過程中細菌的參與，有助于提高發酵海鮮的質量。

3.1 利用微生物加速魚露發酵

3.1.1 細菌加速魚露發酵

細菌各種各樣的代謝方式在魚露發酵過程中產生了重大的作用。Zheng Bin等[14]為了研究在發酵過程中提高魚露質量的方法，從魚露中分離得到了一株產蛋白酶嗜鹽冷桿菌(Psychrobactersp.)，發現該蛋白酶產菌對pH和NaCl濃度變化影響不明顯，卻顯著提高了中嗜鹽微生物總數、蛋白酶活性、可溶性總氮含量和氨基酸總氮含量，加速了魚露發酵，增強了魚露的鮮味和肉味。此外，接種冷桿菌顯著降低了總揮發性堿性氮含量和生物胺含量，具有增強風味特性和非生物胺生成活性。

3.1.2 霉菌加速魚露發酵

霉菌主要是通過產生淀粉酶和蛋白質水解酶對淀粉和蛋白質進行水解從而加速魚露的發酵過程。其中米曲酶、黃曲霉和黑曲霉是生活中最常用的發酵劑，而在魚露的發酵過程中也起到了至關重要的作用。Kim等[15]通過10個月的試驗，研究了不同鹽濃度(10%和20%)條件下，接種曲霉菌的稻曲對鰭魚醬油生化和感官特性的影響。結果表明，與不使用大米曲的魚醬相比，用大米曲和低鹽濃度配制魚醬不僅縮短了發酵過程，且味道、風味和整體接受度更好。童光森[16]在鳙魚中添加用米曲霉制備的曲液，僅發酵30 d就制備出了口感和風味良好的鮮辣魚露。

3.1.3 酵母菌加速魚露發酵

酵母菌是生活中最常見的發酵劑，例如面團發酵、啤酒發酵、酸奶發酵等。在魚露發酵過程中酵母菌由于兼性厭氧的特點加速了發酵過程。Gao Pei等[17]以產自四川的釀酒酵母31和植物乳桿菌120、木糖葡萄球菌135為發酵劑發酵魚露，揮發物經頂空固相微萃取(SPME)提取、氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)分析表明，酯類和醇類是揮發物的主要成分，占所有樣品的50%以上，釀酒酵母31、植物乳桿菌120和木糖葡萄球菌135可促進發酵。王炳華等[18]在鳀魚魚露發酵的前期添加了10%的球形球擬酵母，3 d后得到了具有濃郁鮮香味的魚露產品。

3.2 利用微生物改善魚露風味

傳統魚露之所以會產生獨特的風味是由于魚露本身的微生物或酶會將魚露原料中的蛋白質、脂肪成分分解、發酵和進一步反應，從而形成具有鮮味和香味的化合物體系。縮短周期，會影響魚露的風味，因此，在魚露發酵過程中加入能夠產生風味物質蛋白酶的微生物是魚露快速發酵技術的關鍵條件。細菌、霉菌和酵母菌都對魚露的獨特風味有著巨大的貢獻，魚體在這些微生物產生酶的作用下，將體內的大分子等物質分解為易吸收的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等小分子物質，從而提高了魚露的風味和營養價值。Wakinaka等[19]利用含溴甲酚紫的天冬氨酸指示液從魚發酵食品中分離得到74株菌株，經PCR擴增，均鑒定為嗜鹽四聯球菌，并確認其具有天冬氨酸脫羧酶基因(aspD)，根據其aspD編碼質粒的結構，將其分為14組。將從每組中選擇的菌株和不能進行天冬氨酸脫羧的對照菌株接種到魚露醪中作為發酵劑，分離出具有aspD的菌株在魚露醪液中幾乎完全將天冬氨酸轉化為丙氨酸。此外，該菌株與對照菌株一樣，阻止了生物胺的積累，而各種胺在沒有發酵劑的魚露醪液中積累。綜上所述，使用具有天冬氨酸脫羧酶的嗜鹽嗜血桿菌作為魚露發酵發酵劑，會將天冬氨酸轉化為丙氨酸，改善魚露的口感、風味，阻止魚露產品中生物胺的積累。

3.2.1 細菌改善魚露風味

魚露自然發酵過程中涉及到很多細菌，不同的細菌對魚露的風味起著不同的作用。Wang Yueqi等[20]從魚醬樣品中提取了22816個代謝物離子特征，其中46種代謝物被鑒定為魚露的關鍵化學成分。這些化學成分大多數來源于細菌的代謝產物。此外，絕對定量和味覺活度值(TAV)表明，天冬氨酸和谷氨酸對魚露的鮮味有重要影響。李夢茹等[21]以模擬魚露為基礎接種細菌，并測定其中的揮發性成分，發現戊糖片球菌能有效地改善魚露的風味。

3.2.2 霉菌改善魚露風味

霉菌對魚露風味的影響主要表現在魚露發酵的前期，魚露在發酵前期主要涉及到一種霉菌——米曲霉，米曲酶屬于黃曲霉種屬，是我國傳統釀造醬油的主要菌種，在醬油釀造過程中，米曲霉分泌大量蛋白酶等酶類，形成良好風味的醬油。影響米曲酶生長條件的因素主要是溫度、水分和pH，尤其是水分，34%～45%的水分是米曲酶生長的最佳水分條件。產酶的最適溫度為28～30 ℃。另外在釀酒過程中，米曲酶還可以被作為糖化酶。Ole G M等[22]以鯖魚為基礎發酵魚醬，并以日本曲母為基礎的真菌接種促進了發酵，對發酵產品進行化學分析后結果表明，有21種不同的醬料含有大量的谷氨酸和天門冬氨酸，形成魚露濃郁的鮮味。

3.2.3 酵母菌改善魚露風味

魚露在發酵過程中會產生大量的酵母菌，酵母菌株可分為很多種，不同的酵母菌種發酵后得到的代謝產物不同，這些代謝產物主要包括醛類、酯類、醇類和雙乙酰類等。酵母菌含量、降糖速度和酯酶活性都直接或間接影響酵母發酵后的風味成分。酵母菌對魚露風味的影響主要表現在魚露發酵的中期和后期。其主要可分為啤酒酵母菌和釀酒酵母菌，啤酒酵母菌的代謝產物中含有豐富的營養物質蛋白質、核糖核苷酸和多糖，水解后的代謝產物為魚露提供了鮮味。釀酒酵母菌雖然形態簡單，但生理卻很復雜，代謝方式和途徑也各種各樣，這為魚露發酵過程良好風味物質的產生奠定了基礎。Gao Pei等[23]在羅非魚魚頭水解液中分別添加3個酒酵母、1個乳制品酵母和1個醬油酵母進行比較，不同酵母表現出不同的生長動力學和發酵性能。結果表明，非醬油酵母可用于魚露調味料的復合改性，開發出一種快速發酵魚頭無鹽魚露的工藝，提高魚副產品的利用率，改善魚露的風味。

4 展望

由于魚露傳統發酵技術存在一定缺陷，近年來很多人研究了魚露的快速發酵技術，有保溫技術、外加曲技術、外加酶技術或微生物技術，這些技術通過不同的方法加速了魚露的發酵過程，但關于魚露風味的提高，研究微生物與魚露發酵過程中形成的風味物質兩者之間的關系勢在必行。針對以上問題，探討下一步提高魚露風味的研究趨勢：

添加單一微生物能夠加速魚露的發酵過程，并對其風味進行改善，但快速發酵的魚露風味還是遠遠不如利用傳統發酵技術得到的魚露，因此可以考慮在魚露發酵過程中加入多種產酶微生物，并對其添加比例進行研究，從而獲得更好風味的魚露。

海洋由于黑暗、缺氧、鹽度和溫度低等特殊的生理環境，孕育了豐富的海洋微生物，這些微生物所產的酶類具有與陸地不同的酶學性質，生產周期短、穩定性好且多為胞外酶。將海洋來源的微生物加入到魚露的發酵過程中，不僅能夠較好地改善魚露的風味，還進一步加大了海洋資源的開發力度。

單一微生物改善魚露風味的效果不夠明顯是因為某些微生物的產酶量不夠，且產酶效果不好。利用激光誘變技術誘變出高產酶量的菌株添加到魚露發酵液中，對魚露的營養價值和風味都有很大的提高。