不同提取方法對沙棘蛋白品質的影響

李家煒，喻勤，葉健文，相歡，崔春*

(1.完美(廣東)日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640)

沙棘籽粕是沙棘籽超臨界二氧化碳提取沙棘油后的副產物，目前常被用于沙棘醋[1]、沙棘果醋[2]的制備，大多數的沙棘籽粕被用作動物飼料。沙棘籽粕蛋白質含量豐富(約20%～25%)，含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸以及2種半必需氨基酸，是一種優質的植物蛋白資源[3]。據報道，沙棘籽粕蛋白具有降血糖[4]、調節腸道菌群[5]的作用。除此之外，沙棘蛋白可以酶解制備活性肽如抗氧化肽[6]、醒酒和抑菌肽[7]。因此，高效提取沙棘籽粕中蛋白質是高效利用沙棘籽粕的重要途徑之一。

目前關于沙棘籽粕蛋白的提取多集中在堿溶酸沉的方法上，張文博等[8]以沙棘種仁蛋白的最大提取率為目標，研究了堿溶酸沉法提取沙棘種仁蛋白的工藝，并分析了其氨基酸組成。趙晨偉[9]采用“堿溶酸沉”原理對沙棘蛋白質進行提取，確定了最佳提取條件為固液比1∶12，pH 12，時間40 min，溫度35 ℃。在此條件下可使沙棘籽粕分離蛋白提取率達到79.3%，沙棘蛋白的蛋白質含量為89.67%。凌孟碩[10]以沙棘籽粕為原料，通過堿提、酶法兩步提取后，總提取率為67.24%。上述研究主要集中在堿溶酸沉工藝的優化，未比較不同提取工藝對沙棘蛋白品質的影響。

本研究以脫脂沙棘籽粕為原料，分別采用水提、鹽提、堿溶酸沉、先醇提后堿溶酸沉、先堿溶酸沉后醇提這5種工藝進行沙棘蛋白的提取，分析了5種工藝提取的沙棘蛋白的蛋白質含量、提取率、氨基酸組成和重金屬含量，并在此基礎上比較不同工藝得到的沙棘蛋白的α-淀粉酶抑制活性，確定提取沙棘蛋白的最優工藝，以期為沙棘蛋白的高值化利用提供理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

沙棘籽粕：青?？灯丈锟萍加邢薰咎峁?；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、乙醇、3，5-二硝基水楊酸、豬胰α-淀粉酶等：購自廣州叢源儀器有限公司。

L8900氨基酸分析儀 日立公司；GL21M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀 芬蘭Thermo Scientific公司。

1.2 沙棘蛋白的不同提取工藝

工藝1：水提蛋白，稱取100 g沙棘籽粕，加入900 g蒸餾水，50 ℃攪拌提取2 h，離心取上清，濃縮，凍干即為水提蛋白。

工藝2：鹽提蛋白，將工藝1得到的沉淀，加入10倍重量的蒸餾水(2%的氯化鈉)，50 ℃攪拌提取2 h，離心取上清，濃縮，凍干即為鹽提蛋白。

工藝3：堿溶酸沉提取蛋白，稱取100 g沙棘籽粕，加入900 g蒸餾水，用2 mol/L的氫氧化鈉調節pH至11，37 ℃提取40 min，重復提取3次，8000 g離心25 min收集上清液，用2 mol/L的鹽酸調節pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g離心30 min，收集沉淀，沉淀凍干即為沙棘蛋白。

工藝4：先醇提后堿溶酸沉提取蛋白，稱取100 g沙棘籽粕，加入500 mL濃度為70%的乙醇，超聲30 min，重復2次之后過濾得到殘渣，殘渣加入900 mL的蒸餾水，用2 mol/L的氫氧化鈉調節pH至11，37 ℃提取40 min，重復提取3次，8000 g離心25 min收集上清液，用2 mol/L的鹽酸調節pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g離心30 min，收集沉淀，沉淀凍干即為沙棘蛋白。

工藝5：先堿溶酸沉后醇提提取蛋白，稱取100 g的沙棘籽粕，加入1000 mL的蒸餾水，用2 mol/L的氫氧化鈉調節pH至11，37 ℃提取40 min，重復提取3次，8000 g離心25 min收集上清液，用2 mol/L的鹽酸調節pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g離心30 min，收集沉淀，加入3倍重量的70%乙醇，超聲30 min，重復2次，離心得到沉淀，凍干即為沙棘蛋白。

1.3 沙棘蛋白含量及蛋白提取率測定

蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法[11]。

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1.4 氨基酸組成測定

氨基酸含量的測定采用高效液相色譜法[12]。

1.5 重金屬含量測定

重金屬含量的測定參照GB 5009.268-2016 《食品中多元素的測定》的方法[13]，稱取不同樣16 g，送樣至廣州檢驗檢測集團有限公司進行檢測。

1.6 α-淀粉酶抑制活性測定

α-淀粉酶抑制活性的測定參考Liu等[14]的方法并稍作修改，采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法。在25 mL比色管中加入1 mL淀粉酶溶液和1 mL酶解液混合后，于恒溫水浴箱(37 ℃)中預熱15 min，再加入1 mL淀粉溶液(濃度2%，W/V)充分混合，于恒溫水浴(37 ℃)中準確反應5 min(間隔搖晃數次后)，快速添加2 mL DNS 試劑后于沸水浴中煮沸5 min中止反應，在室溫下冷卻，在波長540 nm處測定吸光度，其中空白實驗不添加酶解液，其他操作相同。

(2)

式中：Aa表示不添加酶解液的吸光度；Ab表示添加酶解液的吸光度。

1.7 數據統計與分析

數據均為3次測定的平均值，并使用Origin 8.0軟件進行作圖，采用Minitab 17.0軟件進行顯著性分析(Tukey方法進行比較)。

2 實驗結果與討論

2.1 不同工藝提取沙棘蛋白

分別采用水提法、鹽水提取法、堿溶酸沉法、先乙醇提取再堿溶酸沉法、先堿溶酸沉再乙醇提取法對沙棘籽粕中蛋白進行提取，蛋白含量和蛋白質提取率見表1。

表1 不同工藝提取蛋白含量和蛋白質提取率的比較Table 1 Comparison of protein content and protein extraction rate by different extraction process

由表1可知，5種提取工藝的蛋白質含量差異較大，其中先醇提后堿溶酸沉工藝提取的蛋白含量最高，達77.86%；先堿溶酸沉后醇提工藝提取的蛋白含量次之，達到71.83%。就蛋白質提取率而言，含有堿溶酸沉工藝的提取率均較高，鹽提工藝的蛋白含量和蛋白提取率最低。與水提法相比，在氯化鈉的作用下，更多的沙棘蛋白殘留在沉淀中。乙醇前處理可以顯著降低沙棘蛋白中黃酮類含量。綜合考慮蛋白質含量和蛋白質提取率，最終選擇先醇提后堿溶酸沉作為沙棘蛋白提取工藝。

由圖1可知，不同工藝提取的蛋白外觀差異較大，5種蛋白顏色由淺至深分別是鹽提蛋白<水提蛋白<先堿溶酸沉后醇提蛋白<先醇提后堿溶酸沉蛋白<堿溶酸沉蛋白。采用堿溶酸沉工藝提取的蛋白樣品顏色均比較深，這可能是堿溶過程中大量黃酮類及木質素與蛋白結合[15]，導致樣品顏色加深。

圖1 不同工藝提取沙棘外觀比較Fig.1 Comparison of appearance of sea buckthorn protein extracted by different process

2.2 不同工藝提取蛋白的氨基酸組成結果

5種工藝提取蛋白的氨基酸組成見表2。

表2 不同工藝提取沙棘蛋白的氨基酸組成百分比Table 2 Amino acid composition of sea buckthorn protein extracted by different process g/100 g

5種工藝提取的蛋白氨基酸組成相同，均含有17種氨基酸，但是含量差異明顯。5種工藝中含量較高的氨基酸種類相同，分別是谷氨酸，其次為精氨酸和天冬氨酸。其中先堿溶酸沉后醇提之后得到的沙棘蛋白具有較高的天冬氨酸和精氨酸含量，而水提蛋白具有最高的谷氨酸含量。精氨酸在所有工藝提取的蛋白中的含量較為突出，與一般的植物蛋白相比較高，前期研究表明，精氨酸具有改善小血管冠狀動脈內皮功能，免疫調節活性[16]，因此推測沙棘蛋白具有其他植物蛋白不具備的特殊生理活性。另外，沙棘蛋白中谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸含量較高，有利于新型調味品的開發[17]。

2.3 沙棘蛋白中重金屬含量分析

重金屬污染食品后，人體吸收后無法分解，積累到一定程度時，會引起中樞神經、血液及各器官的疾病[18]，因此對于沙棘籽粕蛋白中重金屬含量的檢測極為重要。參照《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[19]標注出各種重金屬含量的國家標準，可見堿溶酸沉工藝、先堿溶酸沉后醇提工藝和先醇提后堿溶酸沉工藝得到的沙棘蛋白中各種重金屬含量均低于國標要求，但堿溶酸沉工藝得到沙棘蛋白中鉻含量達到3.19 mg/kg，遠高于國標中的1 mg/kg。

由表3可知，先堿溶酸沉后醇提工藝和先醇提后堿溶酸沉工藝得到的沙棘蛋白中鉛、砷、鎘、汞和鉻含量均明顯低于堿溶酸沉工藝，表明醇提工藝可顯著降低沙棘蛋白的重金屬含量，其中鉻含量下降最為明顯，從3.19 mg/kg降低到0.35 mg/kg和0.53 mg/kg。原因可能是乙醇可提取沙棘蛋白中的黃酮和多酚類物質，黃酮和多酚類物質易與金屬離子形成螯合物。

表3 不同工藝提取的沙棘蛋白重金屬含量比較Table 3 Comparison of heavy metal content of sea buckthorn protein extracted by different process mg/kg

2.4 不同工藝提取沙棘蛋白的α-淀粉酶抑制活性評價

目前體外研究降血糖常以α-淀粉酶、α-葡萄糖甘酶[20]的抑制活性為評價指標。分別測定先醇提后堿溶酸沉工藝、水提工藝和鹽提工藝提取的蛋白加熱前后對α-淀粉酶的抑制活性，見圖2。

圖2 不同工藝提取沙棘蛋白α-淀粉酶抑制活性Fig.2 α-amylase inhibitory activity of sea buckthorn protein extracted by different process注：A表示先醇提后堿溶酸沉沙棘蛋白；B表示水提沙棘蛋白；C表示鹽提沙棘蛋白。

結果表明，80 ℃和90 ℃熱處理之后，先醇提后堿溶酸沉提取的沙棘蛋白和鹽提蛋白的抑制活性降低。鹽提蛋白加熱前后對α-淀粉酶的抑制作用隨著濃度的增加而降低。而水提蛋白80 ℃熱處理之后，隨著濃度的增加，其抑制作用逐漸增加，表現出濃度依賴。但是對于未加熱的水提蛋白而言，隨著濃度的增加，其抑制作用逐漸降低，表明鹽提蛋白可能成為一種潛在的降血糖的活性蛋白。

3 結論

本研究以脫脂沙棘籽粕為原料，對不同沙棘蛋白提取工藝進行系統的研究，研究結果表明，直接堿溶酸沉、先堿溶酸沉后醇提、先醇提后堿溶酸沉這3種工藝的結果接近，其中先乙醇提取后堿溶酸沉得到的沙棘蛋白的蛋白含量最高，為(77.86±2.34)%，蛋白質提取率為(73.18±1.8)%。先醇提后堿溶酸沉得到的沙棘蛋白具有較高的氨基酸含量，氨基酸組成完全，且精氨酸的含量約為15%。乙醇處理之后得到的蛋白重金屬含量較低。先醇提后堿溶酸沉得到的沙棘蛋白具有較高的抑制活性。本研究對于沙棘蛋白的提取及后續的深加工和功能性食品及調味品的制備提供了有效的理論基礎。