酪蛋白-羧甲基殼聚糖美拉德產物的制備及表征

魏玉嬌，郭曉強，周婷

(成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106)

美拉德反應又稱褐變反應，是羰基化合物和氨基化合物的組合反應，改變食品的色澤和風味[1], 在食品加工處理過程中很常見[2]。殼聚糖是甲殼素脫乙酰后(D.D)的產物[3]，是一種天然的堿性多糖。因其結構中含有大量的COOH和NH2，所以它只能溶于稀的有機酸溶液中，這使它的應用受到一定限制[4]。羧甲基殼聚糖(CAS)是殼聚糖改性后的產物。它有很多活性，如增稠、分散、乳化、保濕等。相比于殼聚糖，改性后的CAS在酸性和堿性溶液中均能溶解[5]。酪蛋白(CN)含有人體需要的多種氨基酸，是一種營養價值很高的完整蛋白質，常被當作食品添加劑，有乳化、增稠等作用。其等電點為4.6，一般溶于堿性溶液，不溶于酸性溶液，限制了它的應用。改變蛋白質性質的方法有很多，MRPs是改變蛋白功能特性的有效方法[6]。這種方法安全、綠色，且能進一步提高原料的功能特性，減少原料用量，降低原料成本，拓展它們的應用領域[7]。

在食品領域中，CN和CAS在美拉德反應反面也有研究，谷風林[8]做了酪蛋白和葡萄糖的結合物，證明了在煙草膨莖中添加MRPs可以顯著提高煙草香氣的使用價值和擴大莖絲。趙靜等[9]確定了美拉德反應的最佳反應條件，并在最佳條件下發現了美拉德反應產物的抗氧化活性和自由基清除率。文獻[10]通過美拉德反應，為研發天然的、綠色的抗氧化劑提供了新的方法，制得了一種溶解性和抗氧化能力都更好的產物。文獻[11]使用MRPs對天然的防腐劑進行了改良，制備了一種多功能的食品添加劑，拓展了天然防腐劑的使用。

殼聚糖因水溶性較差，將其改性后得到CAS可以擴增它的應用[12]。酪蛋白的營養價值很高，美拉德反應可以提高酪蛋白的特性。它綠色、安全，被認為是一種前景很好的方法，可以明顯改善蛋白質的功能和性質。提高蛋白質的抗氧化性，生成有抑制各種菌活性的、抗過敏和抗癌作用的美拉德反應產物[13]。本文用干熱法制備美拉德產物，并對其進行表征，對蛋白質的改性研究以及擴展羧甲基殼聚糖的應用都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖(脫乙酰度95.2%)、酪蛋白氨基酸：食品級，源葉生物化學試劑有限公司；異丙醇、磷酸二氫鉀、溴化鉀、四硼酸鈉：分析純，麥客林化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇：化學純，麥客林化學試劑有限公司。

1.2 實驗設備

IS10傅立葉紅外光譜儀 ThermoFisher公司；FW-5壓片機 傅天勝達科技發展有限公司；ZNCL-B磁力攪拌器 科泰實驗設備有限公司；SCIENTZ-10M冷凍干燥機 新芝生物科技股份有限公司；AR224CN分析天平 奧豪斯儀器有限公司；BG-06D超聲波清洗機 邦杰電子產品有限公司；UB-10 pH計 丹佛儀器有限公司；DD5N低速大容量離心機 凱達科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羧甲基殼聚糖的制備

準確稱取4 g CAS，加入40 mL 40%濃度的預配制NaOH溶液，堿性環境中超聲30 min，使其充分溶解。再加入100 mL異丙醇，于30 ℃在磁力攪拌器上攪拌1 h。稱取16 g氯乙酸并溶于40 mL異丙醇溶液中。反應完成后，加入200 mL的95%乙醇溶液停止反應。滴加乙酸將反應體系的pH調至中性，用體積分數為95%的乙醇溶液和無水乙醇清洗羧甲基殼聚糖濾餅，抽濾，收集沉淀。50 ℃干燥直至恒重，干燥后將其研磨成粉末狀，即得到羧甲基殼聚糖樣品。

1.3.2 酪蛋白-羧甲基殼聚糖反應產物的制備

反應產物的制備參考雷濤等[14]的方法并稍作改動。將酪蛋白和羧甲基殼聚糖加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，在室溫下磁力攪拌1 h使其完全溶解并制備成均勻濃度的溶液。按一定比例(蛋白和多糖比為5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、1∶1、4∶5、3∶5)制成含酪蛋白10%的混合溶液，于室溫下超聲攪拌1 h，使糖和蛋白充分混合均勻。預凍24 h后再冷凍干燥48 h，研磨成粉末。過篩，放入含有飽和溴化鉀的密封容器中(相對濕度為79%)并將反應溫度控制在50，55，60，65，70 ℃， pH為7.4，反應時間控制在24，36，48，60，72，84 h中讓其反應， 達到反應時間后冷卻終止反應。取適當的去離子水溶解樣品，離心15 min，取上清液，凍干，研磨即得到樣品。

1.4 美拉德產物的性能測定

1.4.1 褐變指數的測定

分別稱取不同條件下的反應產物0.5 g于試管中，加入15 mL去離子水將其充分溶解。使用分光光度計，在420 nm波長下測量其吸光度。

1.4.2 接枝度的測定

為了測定游離氨基含量并計算接枝程度，使用OPA法。

OPA(鄰苯二甲醛)試劑的配制：使用分析天平準確稱取40.0 mg OPA到100 mL燒杯中。吸取管中的1.0 mL甲醇。20%(W/W)的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液的配制：稱取2 g十二烷基硫酸鈉，溶解于10 mL去離子水中。0.1 mol/L的硼砂溶液的配制：準確稱取3.814 g硼砂，加入100 mL去離子水，超聲直至其完全溶解。分別取5 mL SDS溶液和25 mL硼砂溶液(0.1 mol/L)加入到裝有OPA試劑的燒杯中，再加入100 μL的β-巰基乙醇，然后將燒杯中的液體轉移到50 mL容量瓶中，并用超純水調節體積。

取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL不同比例、不同時間、不同溫度反應前后的樣品溶液，搖勻，35 °C，水浴2 min。倒入石英比色皿中，置于分光光度計中測量。以200 μL去離子水作為空白對照，按下式計算接枝度：

GD(%)=(A0-A1)/A0×100。

式中：A0為反應前溶液的吸光度值；A1為反應后溶液的吸光度值。

1.4.3 自由氨基含量的測定

準確稱量0.1 g的樣品，向其中加入10 mL的去離子水，使用磁力攪拌機，使樣品溶解形成分布均勻的溶液。取事先配制好的OPA溶液4 mL和已經溶解均勻的樣品溶液200 μL加入試管中，搖晃混勻，35 ℃水浴2 min。使用分光光度計在340 nm處測量其吸光值，所得到的結果稱為A樣。在同樣的環境和條件下，以未經過處理的酪蛋白為A標，去離子水為空白對照。按照下式對所配制的樣品中游離氨基含量進行測定：

式中：A樣為OPA試劑加入樣品在 340 nm處的吸光度值；A空為OPA試劑加入水在340 nm處的吸光度值；A標為OPA試劑中加入酪蛋白在340 nm處的吸光度值。

1.4.4 傅立葉紅外光譜

取事先烘干的不含有任何水分的樣品約1 mg放入干凈的瑪瑙研缽中， 在紅外燈下研磨成細粉。估量加入150 mg干燥的且已經在紅外燈下事先研磨好的 KBr一起研磨到它們完全、均勻的、充分地混合，讓它們的粒度為2 μm以下(樣品與 KBr的比例為1∶100～1∶200)，將適量的混合樣品放入干凈的模具中，輕輕搖動模具使樣品均勻，然后用手壓機將其壓成透明片材。在電腦上設置范圍，之后將薄片放到光路中測定紅外光譜，一般先采集KBr背景的紅外光譜測定，然后再采集樣品，范圍為4000～400 cm。

1.5 數據分析

對所測樣品數據均檢測3次，用SPSS 17.0軟件對實驗數據采用Duncan多重比較進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白和多糖比例對反應的影響

控制反應條件pH一定，濕度一定，溫度為60 ℃，反應時間為72 h。CAS/CN對反應的影響見表1。

表1 蛋白和糖比例對反應的影響Table 1 The effects of protein and sugar ratio on the reaction

統計結果表明，不同濃度的酪蛋白和糖對美拉德反應的接枝率和游離氨基含量有顯著影響(P<0.05)。對褐變指數也有顯著影響(P<0.05)。反應底物的用量變化可以影響反應速度。適當的反應比例避免了副反應的發生并且可以提高反應速率。當蛋白和糖濃度不斷增大時，它們之間碰撞的機會會增大很多，這樣有利于反應的進行。然而，蛋白質分子和多糖分子受到空間阻礙，當濃度增加到一定程度時，它們之間的碰撞概率會降低，這對反應是非常不利的。由表1可知，隨著酪蛋白和多糖比例的增加，接枝度先增大后減小，當底物比為5∶4時，褐變指數在0.4左右，褐變程度最大，接枝程度最大，游離氨基含量最低。說明蛋白中的氨基減少，發生了反應。pH值也先不斷下降后趨于平穩，因此蛋白和糖的比例在5∶4左右最適宜。

2.2 溫度對反應的影響

控制反應條件，蛋白和糖的比例為5∶4，pH值一定，濕度不變，不同溫度對反應的影響見表2。

表2 溫度對反應的影響Table 2 The effect of temperature on the reaction

統計結果表明，美拉德反應中溫度起著很重要的作用。當溫度低于60 ℃時，溫度對褐變指數(P<0.05)有顯著影響。褐變指數隨著溫度的升高而增加，但在60 ℃后，褐變指數緩慢下降。 當溫度小于時60 ℃，溫度對接枝度與自由氨基含量有顯著的影響(P<0.05)，接枝度隨著溫度的增大而增大，自由氨基含量隨著溫度的增大而減小。 當溫度大于60 ℃時，接枝度的增長趨于平緩，再升高溫度對接枝度和自由氨基含量影響不顯著(P>0.05)。pH值逐漸減小，是因為氨基酸在堿性介質中表現為陰離子，反應性較強，容易發生反應。發生反應之后，氨基也被消耗，所以自由氨基含量下降，接枝度增加，pH值不斷下降。因此，選擇60 ℃為最佳培養溫度。

2.3 時間對反應的影響

控制反應條件，溫度60 ℃，pH恒定，濕度恒定，蛋白質和糖的比例為5∶4，不同反應時間對反應的影響見表3。

表3 時間對反應的影響Table 3 The effect of time on the reaction

統計結果表明，當反應時間小于72 h時，pH值緩慢下降，時間對接枝度和游離氨基含量有顯著影響(P<0.05)。時間達到72 h后，接枝度增長趨勢漸緩，再升高溫度對接枝度影響不顯著(P>0.05)，隨著時間的延長，褐變指數逐漸增加，效果顯著(P<0.05)。

在蛋白質和多糖之間的反應中，可能發生還原性醛基和氨基之間的反應。因此，反應開始后，隨著不斷地加熱，蛋白中的氨基隨著結構的展開慢慢暴露在分子的表面，加熱后糖和蛋白質連續結合，并且接枝程度逐漸增加。但是過度加熱后會使蛋白質分子中的氨基酸結構被破壞，而且會增加蛋白質之間的相互作用，導致凝聚和沉淀，對反應產生不利影響。因此，在72 h時接枝度最大，游離氨基含量最小，褐變指數為0.6左右，褐變程度較大。

2.4 美拉德產物的紅外光譜分析

本實驗的目的是為了進一步確定蛋白質和多糖是否發生反應以及反應過程的變化。而紅外光譜可以通過不同的吸收峰來表明反應。圖中A代表混合物，B代表美拉德產物，C代表酪蛋白。

當蛋白和糖分子結合后，最明顯的變化就是蛋白質分子中的羥基增多。具體表現在紅外光譜圖上是，在1700～1000 cm-1時出現吸收峰，在3700～3200 cm-1時出現一個寬峰。由圖1可知，B在3700～3200 cm-1和1700～1000 cm-1的吸收對比酪蛋白都有所增加，它們分別是-OH和-CO鍵的吸收峰。由圖1可知，在1650 cm-1處，B的吸收減弱，說明蛋白中的氨基參與了反應，數量明顯減少。

圖1 紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrogram

3 結果與討論

國內外研究蛋白質的改性主要有物理改性、化學改性和酶改性等方面。其中化學改性中的美拉德改性受到越來越多的關注，美拉德改性與其他化學改性相比簡單、安全，而且還能改善蛋白質的多種功能性質。本文運用干熱法使酪蛋白與羧甲基殼聚糖發生美拉德反應，進一步深入研究美拉德反應的條件，從而延伸和拓寬酪蛋白和羧甲基殼聚糖的應用領域。

本研究制備了酪蛋白和羧甲基殼聚糖的美拉德產物，并對產物的一系列特性進行了表征，測定了不同蛋白和多糖的比例、不同溫度、不同反應時間對反應的影響。通過測定產物的pH值、褐變指數、自由氨基含量、接技度來確定最佳反應條件。最終結果表明最適宜反應條件是在60 ℃，相對濕度為79%，CN/CAS比例為5∶4，最終蛋白質濃度為10%的美拉德反應產物反應72 h具有最高的反應程度。 測得其褐變指數為0.697，接枝度為70.09%，自由氨基含量為28.83%。CN、CN/CAS和MRPs的紅外光譜表明，酪蛋白與羧甲基殼聚糖發生美拉德反應。