復(fù)方生地提取液對(duì)銀屑病模型小鼠炎癥水平的影響

★ 李雄英 艾瑛 徐云 鄒立君 何平平 劉少雄 王英（江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 江西 撫州344000）

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，其患病數(shù)占全世界皮膚病患病總數(shù)的0.4 %～0.6 %，占自然人群患病總數(shù)的0.1 %～0.3 %［1］。該病極易復(fù)發(fā)且難以根治，是皮外科重點(diǎn)研究疾病之一［2-4］，目前用于系統(tǒng)治療銀屑病有效的西藥制劑主要有細(xì)胞毒及免疫抑制劑、維甲酸類(lèi)、抗生素類(lèi)及生物制劑等［5-6］，但依然不能根治或?qū)е露喾N毒副作用，因此積極研究高效、低毒副作用的治療銀屑病的藥物制劑具有重要意義。復(fù)方生地提取液用于血熱型銀屑病的治療已取得了滿意的臨床療效，但其主要藥效學(xué)基礎(chǔ)及可能作用機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)采用注射己稀雌酚制備銀屑病模型，觀察復(fù)方生地提取液對(duì)模型小鼠陰道細(xì)胞有絲分裂影響，并進(jìn)一步檢測(cè)血液炎癥因子探討其可能的作用機(jī)制，為其臨床用藥提供一定藥理學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雌性ICR小鼠72只，6～8周齡，SCXK（浙）20080033，合格證號(hào)：0019405，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及其配制 造模材料：己烯雌酚批號(hào)（20131001）、秋水仙堿批號(hào)（20140210）；受試藥：復(fù)方生地提取液配制成低、中、高三種劑量（0.02、0.04、0.08 g/kg），由杭州市第三人民醫(yī)院提供（批號(hào)：140320）；陽(yáng)性對(duì)照藥：復(fù)方青黛膠囊批號(hào)（140403），用前配成0.4 mg/mL，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)水乙醇（批號(hào)20140725，杭州龍山精細(xì)化工有限公司）；95%乙醇（批號(hào)140803601，安徽安特食品股份有限公司）；二甲苯批號(hào)（20140901，中國(guó)杭州化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸批號(hào)（20130621，衢州巨化試劑有限公司）；氨水批號(hào)（20091022，杭州長(zhǎng)征化學(xué)試劑有限公司）；中性樹(shù)脂批號(hào)（20130830，中國(guó)上海標(biāo)本模型廠）；伊紅批號(hào)（20140919，南京建成科技有限公司）；蘇木批號(hào)（20141014，南京建成科技有限公司）；蓋玻片批號(hào)（10212450C，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；石蠟（批號(hào)20140516，上海華靈康復(fù)機(jī)械廠）。

1.4 儀器 MEIKO EC360包埋機(jī)（美康儀器設(shè)備制造高淳縣有限公司）；自動(dòng)脫水機(jī)（SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr）；LEICARM2245切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；ZPJ-1A展片機(jī)（d航機(jī)械設(shè)備廠）；生物顯微鏡B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2圖像分析系統(tǒng)（Motic公司）；MEIKO FT100展片機(jī)（美康儀器設(shè)備制造高淳縣有限公司）；DHG-9140烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；生物顯微鏡B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2圖像分析系統(tǒng)（Motic公司）；載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；Microcl17微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 雌性ICR小鼠72只，6～8周齡，分為6組，分別為正常對(duì)照組、銀屑病模型組、復(fù)方生地提取液低劑量組（0.2 g/kg）、復(fù)方生地提取液中劑量組（0.4 g/kg）、復(fù)方生地提取液高劑量組（0.8 g/kg），陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方青黛膠囊），每組12只。

2.2 造模與給藥 除正常對(duì)照組小鼠腹腔注射（ip）給予每10 g體重0.1 mL生理鹽水外，其余各組均腹腔注射己烯雌酚10 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d（3 d后隔天注射1次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束），使小鼠陰道上皮處于增生狀態(tài)。除正常對(duì)照組和模型組給予生理鹽水外，其余各組于第3天給予相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)30 d。模型制備參考施惠娟研究氧化苦參堿對(duì)銀屑病模型雌激素周期小鼠陰道上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響［8］。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 小鼠血清炎癥指標(biāo)的測(cè)定 末次給藥后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，使細(xì)胞分裂停滯于有絲分裂期。6 h后取血，采用酶勉法測(cè)定血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、內(nèi)皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平探討其可能作用機(jī)制。

2.3.2 小鼠陰道病理學(xué)觀察 取血完畢后，迅速處死小鼠并取陰道組織，放入4 %中性福爾馬林中固定3 d后，經(jīng)取材-固定-水洗-脫水-包埋-切片-HE染色等步驟制備陰道病理學(xué)切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察陰道細(xì)胞的有絲分裂，并計(jì)數(shù)100個(gè)陰道基底細(xì)胞中所出現(xiàn)的有絲分裂細(xì)胞數(shù)，即基底層細(xì)胞有絲分裂指數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 對(duì)銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠炎癥因子血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、血清白介素-8（IL-8）、血漿細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）、血漿血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平明顯升高（P＜0.05,0.01）。與模型對(duì)照組比較，復(fù)方生地提取液低、中劑量（0.2 g/kg）能明顯降低模型小鼠血清TNF-α、血漿VEGF水平（P＜0.05，0.01）；高劑量（0.8 g/kg）能明顯降低模型小鼠血清TNF-α、VEGF、IL-8、及VCAM-1水平（P＜0.05，0.01）。提示復(fù)方生地提取液對(duì)模型小鼠血清炎癥因子有明顯的改善作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=12）

表1 對(duì)銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=12）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，* P＜0.05，**P ＜0.01。

劑量 NO NOS ET-1 TNF-α VCAM-1 VEGF IL-8 IL-2 IL-6組別/g·kg-1 /μmol·L-1 /μm·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 （pg/mL）正常對(duì)照組 - 39.58±6.15 32.19±5.27 60.99±8.79 127.25±8.88 3.75±0.58 497.56±45.59 118.24±11.26 32.26±1.99 109.33±6.54模型對(duì)照組 - 50.07±8.40△△ 41.06±5.48△△ 74.90±8.28△△ 138.50±9.52△△ 4.43±0.38△△ 592.43±62.77△△ 137.18±12.18△△ 35.65±2.85△△ 117.61±5.94△△復(fù)方青黛膠囊 0.5 44.06±7.32 37.85±5.19 69.25±9.66 130.34±8.71* 3.78±0.54** 508.01±53.15** 125.15±11.80* 33.64±2.07* 111.92±6.20*復(fù)方生地提取液 0.2 43.79±9.07 37.43±5.76 68.16±5.61* 131.42±9.32* 3.98±0.59 526.81±38.49** 131.81±6.61 34.61±1.92 115.45±7.91復(fù)方生地提取液 0.4 43.31±6.24* 36.71±5.05* 64.71±9.13* 130.89±9.77* 4.14±0.59 519.03±79.12** 128.63±18.85 34.05±1.33* 113.51±4.99*復(fù)方生地提取液 0.8 43.11±10.93* 36.18±4.87* 63.22±9.01* 131.17±8.32* 3.82±0.43** 508.13±34.73** 125.63±14.37* 33.78±1.95* 112.18±7.87*

4.2 對(duì)銀屑病模型小鼠陰道病理組織影響 正常對(duì)照組小鼠的陰道組織均被覆分化良好的鱗狀上皮，基底層偶見(jiàn)處于核分裂相的細(xì)胞。模型對(duì)照組小鼠的陰道基底層細(xì)胞均增生活躍，有較多細(xì)胞核深染，呈不規(guī)則的分裂或多核狀態(tài)，體積增大，提示模型復(fù)制成功，Van Scott［9］提出的腹腔注射己烯雌酚使小鼠陰道上皮處于增生狀態(tài)模擬人類(lèi)銀屑病表皮增生加速特點(diǎn)，可較好地反映細(xì)胞增殖情況，施惠娟［8］、劉冬平［10］等均采用此方法制備銀屑病模型小鼠。復(fù)方生地提取液組的基底層處于核分裂相的細(xì)胞較模型組減少。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠陰道上皮細(xì)胞基底層細(xì)胞有絲分裂指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，復(fù)方生地提取液高（0.8 g/kg）可顯著降低陰道上皮基底細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)（P＜0.05）。提示復(fù)方生地提取液可改善模型小鼠銀屑病表皮增生過(guò)快病理生理特點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 對(duì)銀屑病模型小鼠陰道細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響（±s，n=12）

表2 對(duì)銀屑病模型小鼠陰道細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響（±s，n=12）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 給藥劑量/g·kg-1 有絲分裂指數(shù)/%正常對(duì)照組 - 3.17±0.75模型對(duì)照組 - 16.00±7.54△△復(fù)方青黛膠囊 - 9.17±3.37*復(fù)方生地提取液 0.2 11.00±6.10復(fù)方生地提取液 0.4 12.00±5.62復(fù)方生地提取液 0.8 8.50±4.09*

圖1 各組小鼠陰道HE染色

5 討論

銀屑病（中醫(yī)學(xué)稱之為“白疕”）是一種以皮膚代謝發(fā)生障礙產(chǎn)生慢性鱗屑性皮損為主要特征的疾病，一旦發(fā)作，則紅斑色鮮、肌膚灼熱、瘙癢劇烈且反復(fù)難愈。中醫(yī)理論認(rèn)為，銀屑病是由風(fēng)邪客于皮膚，血燥不能榮養(yǎng)所致。現(xiàn)實(shí)生活中外感風(fēng)邪致風(fēng)寒或情志內(nèi)傷致郁結(jié)不舒或飲食不節(jié)致濕邪內(nèi)蘊(yùn)而化熱，最終熱邪蘊(yùn)于營(yíng)血，耗傷陰血，血虛風(fēng)燥而致病，因此銀屑病治療應(yīng)以清熱涼血、清熱解毒為主要治則。復(fù)方生地提取液用于血熱型銀屑病的治療已取得了滿意的臨床療效；復(fù)方生地提取液以生地、牡丹皮清熱涼血為君藥；黃芩、金銀花、連翹清熱解毒為臣藥；當(dāng)歸、赤芍活血祛瘀，茯苓皮利水滲濕共為佐藥；甘草調(diào)和為使藥，諸藥合用，共奏清熱涼血、清熱解毒之效。

銀屑病表皮的病理生理主要特點(diǎn)之一為增生過(guò)快，而雌激素周期小鼠陰道上皮增生活躍，有絲分裂增多，細(xì)胞轉(zhuǎn)換加快；本實(shí)驗(yàn)采用雌激素己烯雌酚小鼠腹腔注射，模擬了人類(lèi)銀屑病表皮增生過(guò)快的特點(diǎn)，比較小鼠陰道基底細(xì)胞有絲分裂指數(shù)，可較好地評(píng)價(jià)藥物抑制細(xì)胞有絲分裂作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方生地提取液0.8 g/kg能顯著降低模型小鼠陰道有絲分裂指數(shù)，抑制雌性小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂，提示復(fù)方生地提取液可改善銀屑病表皮增生過(guò)快病理生理特點(diǎn)。

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，免疫異常及血管增生是銀屑病的重要機(jī)理，特別是T淋巴細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的釋放在銀屑病的發(fā)病和維持其基本病理特征方面起關(guān)鍵性作用［11］。促炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白介素 -6（IL-6）［12］、白介素 -8（IL-8）、白介素 -2（IL-2）［13］等與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。①腫瘤壞死因子-α是巨噬細(xì)胞受到脂多糖(類(lèi)毒素)等刺激而釋放，可通過(guò)誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑的表達(dá)而影響角阮細(xì)胞的再生分化和導(dǎo)致表皮中中性白細(xì)胞的浸潤(rùn)；它還作用于表皮成纖維細(xì)胞，使其發(fā)生表型改變；另外，TNF-α還可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增加表達(dá)細(xì)胞問(wèn)粘著分子-1，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞在皮膚的浸潤(rùn)，進(jìn)一步產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。②IL-8又名粒細(xì)胞趨化蛋白、中性粒細(xì)胞激活因子等，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中充當(dāng)很強(qiáng)的白細(xì)胞趨化劑和Kc的絲裂原，在介導(dǎo)T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)中可能起關(guān)鍵作用；銀屑病患者皮損［14］和血清［15］中有高水平IL-8。③細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）屬于免疫球蛋白超家族中的一員，能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞在血管內(nèi)皮沉積和黏附，在炎癥性皮膚病的致病中發(fā)揮重要作用，銀屑病患者血漿中有高水平VCAM［16］。④血管異常是銀屑病發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程的關(guān)鍵，而血管異常是整個(gè)免疫系統(tǒng)及各種細(xì)胞、炎癥因子表達(dá)紊亂的結(jié)果。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、增加血管通透性、誘導(dǎo)血管生成和參與血管重塑等多種功能，是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管新生物質(zhì)之一［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方生地提取液能顯著降低模型小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、內(nèi)皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，提示復(fù)方生地提取液可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥水平改善銀屑病。

綜上，復(fù)方生地提取液既可抑制表皮增生過(guò)快，改善皮損病癥；亦可降低血清促炎癥細(xì)胞因子，改善機(jī)體炎癥病變，消除病因；對(duì)銀屑病模型有較明顯的療效，標(biāo)本兼治。