模擬氮沉降對杉木叢枝菌根真菌侵染率和球囊霉素的影響

汪鷂雄,李 全,沈益康,楊 強,張君波,王艷紅,宋新章

浙江農林大學,省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 杭州 311300

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤中分布最廣泛的一類微生物組分,與農林業生產關系密切,能夠與80%的高等植物形成共生關系[1]。由于AMF的菌絲比宿主植物根系更細且密度更大[1],AMF能夠吸收到宿主植物根部無法觸及的營養物質[2-3],能明顯改善宿主植物的營養狀況。而侵染率是AMF與植物共生關系緊密程度的一個重要標志[4]。球囊霉素在土壤團聚體形成過程中起到了“粘合劑”的功能,能夠提高土壤結構的穩定性和減慢有機碳的分解速度,提高土壤的肥力從而改善宿主植物營養狀況[5]。另外球囊霉素是由AMF的菌絲體和孢子壁層產生的一種糖蛋白,可產生于根內菌絲也可產生于根外菌絲,隨著根系、菌絲和孢子的降解而進入土壤[6],是土壤有機質的重要組成部分[7],因此,球囊霉素一定程度上能反映AMF在土壤中的生存狀況。球囊霉素按照提取的難易程度可分為易提取球囊霉素相關土壤蛋白(EE-GRSP)和總球囊霉素相關土壤蛋白(T-GRSP)[8]。大量研究發現土地肥力情況、土地利用方式、環境條件等均會影響AMF侵染率[9]和球囊霉素[10]的含量及分布。其中,施氮肥顯著影響了AMF活性[11]。然而,關于大氣氮沉降對AMF侵染率和球囊霉素的影響則鮮有報道,氮沉降與施氮肥對AMF的影響是否一致,也還需要進一步的研究。

近年來,由于工業上化石燃料的持續燃燒、農業上氮肥的大量施用、以及畜禽養殖方面產生的污染等,氮的排放量持續增加,大氣中活性氮濃度逐漸升高。大氣氮沉降日益增強,這種趨勢已從發達地區迅速擴展到全球范圍,極大影響了全球氮循環[12]。長期高強度氮沉降輸入森林土壤使有機質、pH值、有效磷等呈下降趨勢[13],并且導致硝酸鹽流失[14-15],而這些土壤理化性質的改變也可能影響AMF活性。此前關于三葉草,大豆和洋蔥的研究顯示氮輸入增加會顯著抑制AMF侵染宿主植物[16-17],而Hepper關于萵苣的研究則與之相反[18],隨著氮增加,AMF侵染率也隨之顯著增加。這些研究更多針對的是草本植物,且大部分是盆栽實驗,而對于野外條件下木本植物與AMF共生關系的研究則極少,尤其是人工林生態系統。

杉木(Cunninghamialanceolata)作為我國最重要的森林資源之一,是我國南方栽培最廣的速生樹種之一,杉木木材的銷售收入是南方許多地區林農主要的經濟收入來源。一方面由于一些林農存在重栽疏養的現象,導致林木材質下降,經濟效益不佳,林農對杉木的種植積極性下降。其次,林農為了獲取更高的經濟效益,砍伐杉木林轉型種植經濟價值更高的經濟樹種,從而導致杉木林面積減少[19]。因此,提高杉木木材品質對于杉木林的可持續經營有著至關重要的作用。目前,杉木林廣泛種植在我國亞熱帶地區[20],而該地方也是我國氮沉降最嚴重的地區,有研究表明我國亞熱帶地區的最大年氮沉降量達到了6.35 g N m-2a-1[21],并且預計有進一步增加的趨勢[22]。盡管學者已經對杉木進行了大量的有關氮沉降的研究,比如氮沉降對杉木幼苗的叢枝菌根真菌氮素吸收的影響[23]和氮沉降對杉木林養分分配的影響[24],但氮沉降對野外杉木AMF侵染率和球囊霉素的影響的關注較少。故本研究以杉木作為研究對象,探究氮沉降對不同季節AMF侵染率和球囊霉素影響,提出并驗證以下3個假設;(1)氮沉降增加了AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(2)季節會影響杉木AMF的侵染率和球囊霉素的含量;(3)氮沉降和季節的交互作用會影響杉木AMF的侵染率和球囊霉素含量。以期為氮沉降背景下的杉木林經營管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗地(119°67′E,30°21′N)位于浙江省杭州市臨安區。該區地處中亞熱帶季風氣候區的北緣,四季分明,氣候溫和,雨量充沛,年均降水量1420mm左右,年均氣溫15.6 ℃,年均無霜期230d左右,土壤為黃壤,地形地貌為低山丘陵。

1.2 實驗設計

試驗樣地的杉木林為10年生杉木林,選取樣地內9棵長勢相近的杉木,平均樹高約3m,平均樹冠面積約2m×2m。以杉木為中心設一個3m×3m獨立小樣方,每個樣方四周用0.5m深的鋁塑板隔開,樣方相隔至少2m。模擬氮沉降處理參照國際上氮沉降模擬研究的試驗方法[25-26],依據我國亞熱帶地區的實際氮沉降量及未來增加趨勢[27],以當地氮沉降率3—3.7 g N m-2a-1為基礎[28],設置2個水平：低氮(N3)為3 g N m-2a-1,高氮(N6)為6 g N m-2a-1。另外設置對照處理Control。共3個處理,每個處理3個重復,隨機設置。從2017年4月起至今,每個月噴施1次,每年12次。具體方法為：每月月初將每個樣方所需噴施的一定量的NH4NO3溶解在水中,利用電動噴霧器,從樹冠上方往下均勻噴灑。對照處理樣方噴灑同量水但不添加氮,以避免處理間因外加水而造成的影響。

1.2.1樣品采集

在2019年1月和4月采集土壤和杉木根系樣品。在每個樣方內,以杉木基部為中心,按東西南北4 個方位,去除枯枝落葉層后,在40cm為長和寬矩形面積內,0—20 cm 土層深度范圍內沿根系采集帶有細根(≤2mm)的根系,用抖土法收集根系表面的土壤將其作為根際土壤[29]。土壤和根系樣品均裝入無菌塑料袋,置于4°C保溫箱中,帶回實驗室。土樣通過篩子(< 2mm)后自然風干,用于球囊霉素和土壤理化性質的測定。根系用自來水沖洗,然后用滅菌的超純水沖洗,選取根徑≤2mm的細根,將洗凈的細根剪成1cm的根段,放入提前配好的FAA固定液(38%的福爾馬林、冰醋酸、70%的酒精,三者按照體積比1∶1∶9配置)保存,用于侵染率的測定。

1.2.2AMF侵染率和球囊霉素的測定方法

侵染率的測定先采用改進的酸性品紅染色法染色[30],然后用網格交叉法測定[4]。易提取球囊霉素(EE-GRSP)和總球囊霉素(T-GRSP)的提取和定量分析參考Wright等[31]和Janos等[32]的方法。

1.2.3土壤理化性質的測定方法

土壤全氮含量采用H2SO4-H2O2消煮后,半微量凱氏法測定[33]。土壤全磷含量用H2SO4-H2O2消煮后,鉬銻抗比色法測定[34]。土壤有效磷用雙酸法,采用[c(HCl)=0.05mol/L和c(1/2H2SO4)=0.025mol/L]的提取液提取酸溶性磷和吸附態磷,采用鉬銻抗比色法,使用可見分光光度計進行測定[35]。土壤有效氮采用堿解擴散法,用1mol/L NaOH溶液水解土壤,使易水解態氮(潛在有效氮)堿解轉化為NH3,NH3擴散后為硼酸吸收。硼酸吸收堿解液中的NH3后再用0.01mol/L H2SO4滴定,然后計算土壤中有效氮的含量[36]。土壤pH值,按照水土比為2.5∶1,采用便攜式pH計測定(FE20,Mettler Toledo,Switzerland)[37]。

1.2.4數據分析

利用SPSS 17.0軟件進行統計分析,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)結合最小顯著差異法(LSD)比較不同氮處理下AMF侵染率、易提取球囊霉素、總球囊霉素含量和土壤有效氮磷比的差異性。采用可重復雙因素方差分析(General Linear Model;GLM過程,SPSS 17.0)分析氮添加和季節及其交互作用對杉木林土壤的AMF侵染率、易提取球囊霉素、總球囊霉素和土壤有效氮磷比的影響。采用Pearson相關性分析土壤理化性質與侵染率、易提取球囊霉素和總球囊霉素的相關性。圖由sigmaplot12.5軟件制作,數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 杉木AMF侵染率

如圖1所示,無論在冬季和春季,與對照相比,N3處理均顯著增加了AMF侵染率,而N6處理無顯著影響。其中,在冬季,N3處理顯著增加了59.71%(P<0.05),在春季,N3處理顯著增加了539.50%(P<0.05)。相同氮沉降處理下,冬季的AMF侵染率均顯著高于春季,分別增加89.27%(Control),57.15%(N3)和67.68%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節均顯著影響杉木AMF侵染率(表1)。

圖1 不同氮沉降處理對杉木AMF侵染率的影響

2.2 杉木根際土壤易提取球囊霉素含量

如圖2所示,在冬季,與對照相比,N3處理的根際土壤易提取球囊霉素含量無顯著變化(P>0.05),N6處理下的根際土壤易提取球囊霉素含量顯著提高了50.19%(P<0.05)。而在春季,N3相比對照顯著降低了16.80%(P<0.05),N6相比對照顯著降低了9.80%(P<0.05)。相同氮沉降處理下,冬季的易提取球囊霉素均顯著低于春季(P<0.01),分別降低了44.78%(Control),35.55%(N3)和8.02%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤易提取球囊霉素含量(表1)。

圖2 在不同季節不同氮沉降處理對杉木根際土壤易提取球囊霉素含量的影響

2.3 杉木根際土壤總球囊霉素含量

如圖3所示,在冬季,氮沉降處理對杉木根際土壤總球囊霉素含量無顯著影響(P>0.05)。在春季,N6處理下的杉木根際土壤總球囊霉素的含量比對照顯著增加了22.26%(P<0.05)。相同氮添加情況下,冬季的杉木根際土壤總球囊霉素顯著低于春季,其中分別降低了58.81%(Control),52.21%(N3),和60.39%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤總提取球囊霉素含量(表1)。

圖3 在不同季節不同氮沉降處理對杉木根際土壤總球囊霉素含量的影響

2.4 杉木根際土壤有效氮磷比

如圖4所示,在冬季,氮沉降處理顯著增加杉木根際土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3處理的土壤有效氮磷比比對照顯著增加了42.22%(P<0.05)。在春季,氮沉降處理顯著增加杉木根際土壤有效氮磷比(P<0.05)。N3處理的土壤有效氮磷比比對照顯著增加了104.30%(P<0.05)。相同氮添加情況下,冬季的杉木根際土壤有效氮磷比顯著高于春季,其中分別增加了759.95%(Control),498.61%(N3),和477.98%(N6)。雙因素方差分析表明氮沉降和季節及其兩者的交互作用均顯著影響杉木根際土壤有效氮磷比(表1)。

圖4 在不同季節不同氮沉降處理對杉木根際土壤有效氮磷比的影響

表1 氮沉降和季節對杉木AMF侵染率和球囊霉素的雙因素方差分析

2.5 AMF的侵染率、球囊霉素含量和土壤理化性質的相關性

由表2可見,Pearson相關性分析表明,AMF侵染率與土壤有效磷有極顯著負相關的關系(P<0.01),與pH值有極顯著正相關關系(P<0.01),與有效氮磷比有極顯著正相關關系(P<0.01)。易提取球囊霉素和總球囊霉素含量與土壤有效磷有極顯著正相關關系(P<0.01),與pH值有極顯著負相關關系(P<0.01),與有效氮磷比有極顯著負相關關系(P<0.01)。

表2 杉木AMF侵染率,球囊霉素與土壤理化性質的相關性分析

3 討論

3.1 氮沉降對杉木AMF侵染率和球囊霉素的影響

在冬春季節,適當的氮添加(3 g N m-2a-1)顯著提高了AMF侵染率,這與我們的假設(1)一致。與Johnson等的研究結果相似[38],其研究表明在草原土壤中,氮添加顯著增加了AMF侵染率。原因可能是氮添加使得植物可以利用的有效氮增加,根系吸收營養物質的方式(尤其是磷元素)無法滿足植物自身的氮磷營養平衡,因此通過AMF侵染根系以便獲取土壤中的有效磷[39],從而使得AMF侵染率增加[40]。相關性分析AMF侵染率與有效氮磷比顯著正相關。我們的實驗結果表明氮沉降顯著增加了土壤有效氮磷比,間接支持了上述觀點。在冬季,氮沉降增加易提取球囊霉素含量。Treseder等發現氮添加會增加AM真菌的侵染率和菌絲長度,這導致土壤中菌絲的生物量增加[41],這些根外菌絲更新或者降解后引起了土壤中易提取球囊霉素的增加[42]。而春季的易提取球囊霉素是受到氮添加的抑制的,原因可能是春季溫度上升,刺激了AMF等土壤微生物的增長。更進一步研究發現,相比真菌,細菌對氮增加的更加敏感,更有利于細菌的增加,從而到導致了真菌細菌比降低[43]。同時易提取球囊霉素不穩定,容易被細菌快速分解[44],從而導致易提取球囊霉素含量低。盡管AMF侵染率提高,但在春季仍呈現出氮添加減少了易提取球囊霉素含量的現象。在冬季氮添加增加了總球囊霉素,但是未達到顯著水平,而春季,氮添加顯著增加了總球囊霉素含量。杉木由于氮添加,生長發育受到有效磷限制,它們可能會傾向于投資一些獲取磷能力更強的AMF類群,比如巨胞囊霉科[45]。而巨胞囊霉科真菌產生的根外菌絲多于球囊霉科真菌[46],增加了根外菌絲的生物量。然而菌絲的降解需要一段時間[47],且總球囊霉素是較為穩定的球囊霉素[44],不易被微生物分解,從而直到春季氮添加才顯著提高了總球囊霉素含量。由于球囊霉素是土壤團聚體形成的重要粘合劑,且土壤團聚體形成是影響土壤碳固持和碳穩定的重要機制[31]。無論在春季還是冬季,氮沉降均提高了總球囊霉素含量,表明氮沉降有利于土壤團聚體的形成,從而有利于土壤的碳穩定。可能意味著氮沉降能夠減緩土壤中碳的釋放,進而減少杉木林溫室氣體的排放。

3.2 季節變化對杉木AMF侵染率和土壤球囊霉素的影響

在對照處理下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,支持了我們的假設(2)季節變化影響了杉木AMF的侵染率。原因可能是相比于冬季,春季溫度上升,微生物活性增強,分解有機物釋放出更多的營養物質,便于根系的吸收,從而減少了對AMF的依賴,進而導致AMF侵染率下降[48]。此外,侵染率和土壤有效氮磷比呈極顯著正相關,春季土壤的有效氮磷比顯著低于冬季,也支持了上述觀點[49]。在對照處理下,春季的易提取球囊霉素和總球囊霉素含量均顯著高于冬季。原因可能是春季微生物活性增強,土壤中的其他微生物與AMF競爭,AMF獲得的碳源比冬季少,前一個季節產生的菌絲大量降解,因此春季的球囊霉素含量顯著高于冬季[47]。鑒于球囊霉素在土壤團聚體形成中的獨特作用[31],相比較冬季而言,春季更有助于土壤團聚體的形成,有助于減緩春季土壤碳的釋放,也有助于減少于營養物質的淋失[50],從而保障植物養分供應。在氮添加處理下,春季的易提取球囊霉素和總球囊霉素含量均顯著高于冬季,這與我們的假設(3)不一致。表明氮沉降并未改變季節因素對易提取球囊霉素和總球囊霉素的影響。

4 結論

在冬春季,氮沉降提高了杉木林AMF侵染率和土壤總球囊霉素含量。表明氮沉降使杉木與AMF的共生關系更加緊密,植物依賴于AMF吸收更多的養分,從而利于植物在逆境中的生長。在相同氮添加情況下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,而易提取球囊霉素和總球囊霉素含量則顯著高于冬季。這表明隨著季節的變化,杉木對AMF的依賴度也會隨之變化。在相同氮添加情況下,春季的AMF侵染率顯著低于冬季,而易提取球囊霉素和總球囊霉素含量則顯著高于冬季。表明在兩者交互作用下,氮沉降并未改變季節因素對杉木與AMF共生關系的影響。