不同施氮方式和施氮量對馬尾松和木荷幼苗根系土壤細菌群落的影響

郭萍萍, 黃幸然, 吳旺旺,3, 鄭麗麗, 方 熊,*, 易志剛

1 福建農林大學資源與環境學院/土壤環境健康與調控福建省重點實驗室, 福州 350002

2 福建閩江河口濕地國家級自然保護區管理處, 福州 350200

3 平潭綜合實驗區市政園林有限公司, 福州 350400

20世紀以來,隨著科技進步和工農業的快速發展,化石燃料以及氮肥大量使用,人類向大氣中排放的含氮化合物迅速增加。據估算,大氣氮沉降量從1860年約31.6 Tg N/a增加到1995年的100 Tg N/a,并持續增加,2050年預計達到200 Tg N/a[1]。我國已成為繼歐洲和北美之后的世界第三大氮沉降集中區[2],2000—2010年間大氣氮沉降量平均增加了0.35 Tg N/a[3],我國15%的陸地氮沉降量超過臨界值30 kg N hm2a-1以上[4]。

大氣氮沉降是全球氮素循環的一個重要過程,對陸地生態系統的物質平衡和可持續發展產生了重要影響。氮的大量輸入引起了一系列的生態問題：如土壤酸化[5],降低土壤微生物生物量[6]；影響土壤溫室氣體的釋放[7]；影響植物的生長[8],造成植物死亡率上升[9],從而改變森林生態系統的生物多樣性和服務功能。

細菌是土壤微生物的重要群落,參與營養元素循環、凋落物降解和土壤肥力變化等過程[10]。細菌群落能夠對土壤生態系統生理生化過程做出敏銳反應[11]。已有研究表明氮沉降增加會改變土壤氮素循環過程,導致土壤C/N 降低[12],改變土壤酸堿基離子平衡,影響土壤硝化和反硝化作用[13],導致土壤細菌群落結構改變[14-15]。郝亞群等[16]通過野外模擬大氣氮沉降試驗,發現亞熱帶地區杉木幼林土壤高氮處理之后,酸桿菌門平均相對豐度下降,變形菌門平均相對豐度增加。劉蔚秋等[17]研究林緣和林內兩個生境發現,施氮后無苔蘚土壤細菌數量減少,林內比林緣減少更明顯。Compton等[6]利用Biology和分子技術研究發現,長期施氮能夠降低微生物量碳,改變固氮微生物群落結構。張海芳等[18]采用高通量測序技術研究發現,氮素和水分輸入改變后,水分可改變氮添加對土壤細菌群落組成、豐度的影響。還有研究表明,施氮能夠降低細菌豐度[19],改變真菌與細菌比率[20],從而改變土壤微生物群落結構,影響生態系統生物地球化學循環。當前,氮沉降對土壤細菌多樣性和群落組成的影響并不十分明確。

已有研究表明,平均52%—59%的氮沉降被植物冠層截留[21],這部分氮量能夠被植物冠層吸收和轉化,滿足生長季所需氮量的1/3[22],造成植物凋落物、根系分泌物、養分吸收速率和土壤性狀的差異[23],從而使到達土壤中的氮量降低。目前我們對大氣氮沉降的研究主要通過土壤表層或者林下直接施氮的模擬實驗,忽略了植物冠層對氮沉降的吸收和利用,可能高估了氮沉降對土壤中生理生化的影響[24-25]。

因此,本研究以土壤細菌群落為研究對象,設置了2種氮添加方式(土表施氮SAN、葉面施氮LAN)、3個氮濃度,以探討不同施氮方式和施氮量對土壤細菌多樣性和群落組成的影響,為更加深入探討氮沉降對土壤生態系統影響研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本研究選取亞熱帶典型樹種馬尾松(PinusmassonianaLamb.,P.massoniana)和木荷(SchimasuperbaGardn.et Champ.,S.superba),于2012年3月將生長狀況相近的1a齡馬尾松、木荷幼苗分別移栽至溫室的花盆中(高30 cm、直徑44 cm)。待2個月緩苗后進行實驗處理。根據廣州2006年大氣氮沉降量為5.6 g N m-2a-1[26],設置3個氮添加處理：對照(CK,5.6 g N m-2a-1)、中氮(mN,15.6 g N m-2a-1)、高氮(hN,20.6 g N m-2a-1)。每個氮添加水平下設置2種氮添加處理方式：土表施氮(SAN：直接用花灑將溶液均勻灑在土壤表層)；葉面施氮(LAN：從幼苗頂端用花灑噴灑時用塑料薄膜圍在幼苗周圍,防止溶液噴灑到盆外,盡量保證全部均勻噴灑在植株上)。共計12個處理,每個實驗處理設置6個重復。依據廣州年降雨量約為1700 mm,其中80% 分布在雨季(4—9月),每周五噴施NH4NO3,CK、mN、hN處理每盆所需NH4NO3量分別為0.047、0.130、0.172 g[27]。

1.2 樣品采集

于2013年雨季(4月中旬)和旱季(10月中旬)進行兩次采樣。采樣前移除盆栽中的凋落物,在植物周圍約10 cm半徑處用土鉆采集0—20 cm土壤樣品3個,同一處理隨機2盆采集的土壤樣品混合為一個樣品,每個實驗處理得到3個重復樣品。采土后迅速挑出細根和碎石,過篩,分成兩份：一份自然風干用于理化性質分析；另一份分別將3個重復待分析樣品混勻為一個待分析樣品,貯存于-80 ℃用于PCR-DGGE分析。

1.3 樣品分析

(1)土壤理化性質分析

(2)土壤細菌群落分析(PCR-DGGE)

本研究采用土壤DNA提取試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Soil(Q-Biogen, MP Biomedicals, CA, USA)提取土壤微生物總DNA。以土壤總DNA為模板,通用引物UF：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ 和引物UR：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′[29]；PCR反應程序：94 ℃(5 min)；94 ℃(1 min),55 ℃(1 min),72 ℃(2 min),30個循環；72 ℃(10 min),進行16S rRNA基因接近全長擴增(約1600 bp)。以16S rRNA基因產物為模板,選擇大部分細菌特異性較高的V3區作為擴增片段,采用引物GC-341F：5′-GC-CCTACGGGAGGCA GCAG-3′(GC-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)和534R：5′-ATTACCGCGGCTGCT GG-3′[29]；Touch-down PCR反應程序為：94 ℃(7 min)；94 ℃(1 min),65 ℃(1 min),每個循環-1 ℃,72 ℃(90s),10個循環；94 ℃(1 min),55 ℃(1 min),72 ℃(90 s),20個循環；72 ℃(10 min),進行16S rRNA基因V3區長度約200 bp的擴增。

PCR采用30 μL反應體系：15 μL 2×Taq Mastermix、1 μL引物1、1 μL引物2、1 μL DNA模板、12 μL ddH2O；PCR擴增實驗中均同時采用陰性對照。

根據擴增產物的片段長度,選擇濃度為8%(acrylamide/bis-acrylamide 37.5∶1)的聚丙烯酰胺凝膠進行條帶分離。變性梯度為45%—60%(100%的變性劑為含有去離子甲酰胺40%、尿素7 M的混合物)。電泳溫度62 ℃,條件120 V,10 min；60 V,990 min。銀染法染色,拍照保存。DGGE凝膠中切下、回收、擴增、純化特異性的、共有的優勢條帶,選擇pEASY?-T1 Cloning Kit試劑盒克隆。克隆成功的陽性克隆產物由上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.4 數據處理

(1)

(2)

式中：i為泳道中第i條條帶,Pi為泳道中第i條條帶灰度占該泳道總灰度的比例。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

表1 土壤理化性質

表2 氮水平和氮添加方式對土壤理化性質的影響(多因素方差分析)

2.2 DGGE圖譜分析和細菌多樣性分析

DGGE指紋圖譜得到多條清晰條帶,說明土壤細菌群落豐富。

土壤細菌香農威納指數(H)和辛普森優勢度指數(D)表明,氮添加方式影響土壤細菌多樣性。旱季LAN處理,土壤細菌多樣性高于SAN處理；雨季LAN處理,木荷土壤細菌多樣性高于SAN處理,馬尾松土壤細菌多樣性與SAN處理差異不大。氮水平之間,馬尾松土壤細菌多樣性隨氮添加水平增加先降低后增加,木荷土壤細菌群落多樣性施氮處理后表現為增加(表3)。

表3 氮添加量和添加方式對土壤細菌群落多樣性的影響

2.3 DGGE條帶序列、系統進化樹及不同處理主要菌群相對豐度分析

聚丙烯酰胺膠中回收不同位置的條帶64條(圖1),克隆測序獲得其中34條條帶序列,均在GenBank數據庫中搜索到相似菌株序列,且除B55,相似度均高于95%(表4)。

圖1 馬尾松和木荷根系土壤細菌16S rRNA V3區變性梯度凝膠電泳圖譜(DGGE)

表4 DGGE回收條帶序列比對結果

馬尾松和木荷土壤細菌群落屬于Clostridia、Actinobacteria、Chloroplast、Cyanobacteria、Saccharibacteria、Acidobacteria_Gp1、Flavobacteria、Acidobacteria_Gp3、Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria等10個不同的類群(圖2)。

圖2 土壤細菌群落系統進化樹

馬尾松土壤細菌群落的優勢菌群為Acidobacteria_Gp1(14.2%—33.3%)、Gammaproteobacteria(0%—29.4%)和Alphaproteobacteria(7.0%—29.2%)。氮添加方式之間,雨季LAN處理,土壤Acidobacteria_Gp1相對豐度顯著高于SAN處理(F=16.465,P=0.015),土壤Alphaproteobacteria相對豐度顯著低于SAN處理(F=12.147,P=0.025)；旱季LAN處理,土壤Acidobacteria_Gp1相對豐度也顯著高于SAN處理(F=23.492,P=0.008)(圖3)。氮水平之間,SAN處理對土壤細菌類群相對豐度影響不大,而LAN處理增加土壤細菌類群相對豐度。雨季,SAN-hN處理增加酸桿菌門Acidobacteria(Acidobacteria_Gp1、Acidobacteria_Gp3)相對豐度。旱季,施氮增加土壤Actinobacteria相對豐度,LAN-mN增加酸桿菌門Acidobacteria(Acidobacteria_Gp1、Acidobacteria_Gp3)相對豐度。雨季和旱季,土壤變形菌門Proteobacteria(Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria)相對豐度均隨氮水平增加而增加。不同季節之間,SAN處理,雨季土壤Alphaproteobacteria相對豐度顯著高于旱季(F=109.308,P<0.001)。

圖3 不同處理條件下馬尾松和木荷根系土壤細菌相對豐度

木荷土壤細菌群落的優勢菌群為Acidobacteria_Gp1(16.7%—36.5%),并出現了Flavobacteria、Chloroplast、Cyanobacteria和Clostridia。氮添加方式之間,雨季LAN處理,土壤Acidobacteria_Gp1相對豐度顯著高于SAN(F=83.659,P=0.001),旱季LAN處理,與SAN處理沒有顯著差異。氮水平之間,土壤細菌類群相對豐度隨氮水平的升高而降低。雨季,施氮處理使土壤Cyanobacteria相對豐度升高,SAN處理使變形菌門相對豐度增加；旱季,土壤酸桿菌門相對豐度隨氮水平的升高而降低,LAN處理使變形菌門相對豐度升高。土壤Clostridia僅出現在施氮處理中。不同季節之間,LAN處理,旱季土壤Chloroplast顯著高于雨季(F=55.740,P=0.002)(圖3)。

2.4 土壤細菌群落與環境因子的相關性分析(RDA)

馬尾松土壤RDA前2個排序軸分別解釋35.5%和23.8%的土壤細菌種群與環境因子之間的關系。雨季樣品主要集中在第二、三象限,旱季樣品主要集中在一、四象限,說明第一軸可以解釋土壤細菌群落對氮添加的響應受到季節的影響。CK、mN、hN樣品大致是由左下到右上分布,施氮量能夠影響土壤細菌群落組成。土壤pH(F=1.721,P=0.042)與馬尾松細菌群落變化顯著相關,能夠解釋14.9%的細菌群落變化(圖4)。

3 討論

圖5 木荷根系土壤細菌群落與環境因子的RDA分析

本研究還發現,土壤細菌群落組成對不同施氮方式和施氮量的響應受季節影響(圖4, 5)。SAN處理,雨季馬尾松土壤Alphaproteobacteria相對豐度顯著高于旱季(F=109.308,P<0.001)(圖3)。季節引起的差異主要由土壤水分、溫度等氣候條件、植物生長狀況和微生物可利用底物等導致的。廣州4月為雨季初,土壤溫度升高、降水量增加,但此時植物生長緩慢,微生物可利用底物較少。10月為雨季末旱季初,植物生長旺盛,土壤凋落物累積,分解速率較快,微生物可利用底物較多,施氮使土壤中氮素不斷累積,促進了異養型細菌的生長繁殖[16]。同時,土壤含水率影響微生物分解土壤有機質的過程,促進養分運輸,進而影響土壤微生物生長[46]。本研究發現,旱季施氮處理,馬尾松放線菌門(Actinobacteria)相對豐度升高(圖3)。張海芳等認為,放線菌門Actinobacteria相對豐度在常規條件下施氮顯著升高,但在灌溉條件下施加hN時顯著降低,可能與其自身在不同水分條件下的形態特征有關,放線菌門對氮增加的響應依不同的水分狀況存在差異[18]。因此,研究不同施氮方式和施氮量對土壤細菌群落的影響有必要考慮水分的影響。

4 結論