蛋白質谷氨酰胺酶的重組表達與發酵條件優化

李靜竹，胡夢君，張建華

(上海交通大學 農業與生物學院，上海，200240)

植物蛋白相較動物蛋白有較多的營養素和更少的卡路里，因此近年來以植物蛋白為原料的相關食品深受健康人士的推崇[1]。然而核桃、杏仁等植物蛋白飲品在加工過程中易受pH和化學添加劑等因素的影響，從而出現不同程度的分層、絮凝、沉淀等現象[2]。盡管在偏酸性液態食品中pH與植物蛋白的pI接近是誘因之一[3]，但其主要原因是大多數植物蛋白含有大量的谷氨酰胺殘基和天冬酰胺殘基，易形成氫鍵使得蛋白質聚集沉淀[4]，進而影響蛋白的乳化性、氣泡性和凝膠性等功能性質，降低產品品質[5]。為有效解決植物蛋白生產加工中的上述難題，一般采用脫酰胺的方法對植物蛋白進行處理。

目前，工業上廣泛采用酸堿濕熱法和酶法對植物蛋白進行脫酰胺處理。酸法處理常會涉及高溫，易引起蛋白質的水解，從而產生不良風味,影響產品品質。酶法處理可以有效脫去大豆蛋白和燕麥蛋白等植物蛋白的谷氨酰胺殘基上的氨基，提高蛋白的溶解度。常用的酶有胰凝乳蛋白酶[6]、轉谷氨酰胺酶[7]和肽谷氨酰胺酶等，但這些酶有一定的局限性，如轉谷氨酰胺轉氨酶底物專一性不強[8],肽谷氨酰胺酶對大分子蛋白質作用甚微[9]。因此，專一性強和底物特異性好的蛋白質谷氨酰氨酶(protein-glutaminase,PG)引起了越來越多的關注。

PG最初是在2001年被日本學者YAMIGHCHI等[10]從土壤中的解脘金黃桿菌發酵液分離得到。PG一般以含有信號肽的前體形式表達，需經酶切為分子量約20 kDa的成熟酶分子后才有活性[11]。研究發現PG對羥基苯氧基-谷氨酰胺-甘氨酸(Cbz-Gln-Gly)和酪蛋白等底物有脫酰胺活性[10]，且不會造成蛋白質的水解，底物專一性很強，安全有效。PG對米谷蛋白[11-12]、燕麥蛋白[13]等均有良好的脫酰胺作用，且處理后其起泡性、凝膠性和溶解度等功能性質均得到一定改善。目前PG已作為國家批準的食品添加劑，但其生產菌解脘金黃桿菌發酵液中PG的酶活力僅為0.258 U/mL[10]，難以工業應用，因此提高菌株產PG的能力非常重要。

對PG重組表達已有諸多研究，KIKUCHI等[14]置換PG信號肽，構建谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum) pPK4:pro-mPG表達體系，表達的帶前導肽(leader peptide，pro)的PG經絲氨酸蛋白酶酶切后成功獲得成熟肽(mature peptide，mPG)；汪正華等[15]通過重疊延伸PCR法合成PG的全長基因，構建BL21/pET32a(+)：mPG表達體系，經誘導后得到以包涵體的形式表達的mPG，再經變性、復性處理后測得該mPG的酶活力為0.371 U/mL。以上研究構建的菌株或需IPTG誘導表達，或產酶量不高，無法達到商業化生產的要求。因此，構建可以較高效表達此酶且無需誘導劑的表達體系尤為重要。

本文以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pHT43為表達載體，并將其誘導型啟動子Pgrac替換為強組成型啟動子P43[17-18]，構建重組質粒pHT43:pro-mPG(P43)，將其轉化至BL21(DE3)[19]中，實現pro-mPG的胞內可溶性表達。采用胰蛋白酶對pro-mPG酶切，獲得具有一定酶活力的成熟mPG。通過培養基配方和培養條件優化，進一步提高酶活。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌Top10，BL21(DE3)為本實驗室保藏;質粒pHT43,淼靈生物有限公司;pHT43:pro-mPG(P43)為本實驗構建。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、氨芐西林,日本OXIDE公司；UNIQ-10質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、丙烯酰胺、3-Truecolor預染蛋白Marker、限制性內切酶KpnI和SmaI、T4連接酶、脫脂奶粉、10×TBST、異丙基-β-D巰基半乳糖苷,上海生物工程有限公司；MixPCR、核酸染料、200 bp Marker 購自TaKara；His-tag單克隆抗體、羊抗鼠抗體、ECL顯色發光試劑盒,上海翊圣生物有限公司；其他培養基及有機、無機試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；超純水系統，美國Mili-Q公司；高壓滅菌鍋，日本Tomy公司；恒溫培養搖床，深圳市顯控自動化技術有限公司；微量臺式離心機，德國Eppendorf公司；超聲波細胞破碎儀，SONICS公司；超微量分光光度NanoDrop 2000c，美國Thermo Forma公司；PCR儀， Bio-Rad Laboratory；微波爐，韓國LG公司；酶標儀，TECAN；電泳儀，Bio-Rad Laboratory；轉膜儀，Bio-Rad Laboratory；顯影儀，ChemiDoc XRS+。

1.3 方法

1.3.1 PG基因的片段合成設計及其表達載體的構建

利用pHT43構建表達質粒。選用強組成型啟動子P43替換pHT43上的原有的啟動子Pgrac[20]， P43序列后緊接著pHT43中自帶的核糖體結合位點(ribosomebinding site，RBS)和信號肽SamyQ序列，其后為編碼PG的前導肽和成熟肽序列(Genbank：AB046594)，并在成熟肽N端添加6個組氨酸，片段全長1 359 bp，由上海派森諾基因科技公司人工合成。選擇質粒上的KpnI和SmaI作為酶切位點，將合成的目的片段與被KpnI和SmaI酶切的pHT43通過T4連接酶連接，構建重組質粒pHT43：pro-mPG(P43)。雙酶切及酶連接體系參照韋雪芳等[21]的方法。

1.3.2 PG基因的克隆及其質粒酶切鑒定

將重組質粒pHT43:pro-mPG(P43)及pHT43空載分別轉化至E.coliTop10感受態細胞中，加入600 μL的LB液體培養基，在37 ℃、200 r/min培養1 h。取出復蘇的Top10感受態細胞并接種于含100 μg/mL氨芐西林的5 mL LB液體培養基中，37 ℃過夜培養。次日提取質粒并進行酶切驗證。

1.3.3 PG基因重組表達菌E.coliBL21的轉化及其陽性轉化子的鑒定

將重組質粒和空載分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，轉化方法與培養條件同1.3.2。將復蘇液均勻涂布于含100 μg/mL氨芐西林的LB平板上，37 ℃過夜培養。次日挑取平板上的單菌落轉接至1 mL LB(含100 μg/mL氨芐西林)液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養12 h。取500 μL加熱煮沸15 min，作為DNA模板進行PCR擴增檢測。利用生物軟件oligo設計上下游引物，分別為F2499:5’-CTTTCAGCCGACT CAAACATCA-3’；R3013:5’-GTAAGGTATAAACTTTTCAGTTGCAGA-3’。

PCR反應體系為：菌液DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Mix master 12.5 μL，加無菌水補足至25 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，72 ℃延伸5 min。將目的條帶切膠回收并測序。測序完全正確的陽轉子-80 ℃保存備用。

1.3.4E.coliBL21陽轉子的誘導表達與發酵液超聲處理

將重組菌和空載菌株在LB平板上劃線活化。挑取單菌落，接種于4 mL含100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養基，在37 ℃、200 r/min過夜培養。以5%接種量將上述兩種菌液分別轉接至LB液體培養基中(100 μg/mL氨芐西林)，于37 ℃、200 r/min搖床培養至OD600為0.8左右開始計時，分別取上述菌株培養4、8、24 h的菌液各1 mL，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，棄去上清，用1×PBS(pH 7.2)緩沖液洗滌菌體沉淀2次。再加入500 μL的1×PBS充分重懸菌體，將其置于冰上進行超聲破碎(功率為40%，10 s/10次)。超聲后菌液于4 ℃、8 000 r/min 離心1 min，沉淀用1×PBS溶解。采用Nanodrop測定重組菌的超聲破碎全菌液、上清液及沉淀的蛋白濃度。

1.3.5E.coliBL21陽轉子的SDS-PAGE分析、鎳柱純化以及Western blot驗證

將蛋白樣品濃度調整為5～6 mg/mL，與4×SDS蛋白上樣緩沖液按體積比3∶1混合、煮沸，進行SDS-PAGE凝膠電泳：設置恒壓80 V，待樣品中的溴酚藍到達濃縮膠與分離膠的界線時，將電壓調至120 V。采用NTA-Ni柱對蛋白樣品進行純化，采用不同濃度的咪唑溶液(20、50、100、250 mmol/L)分步洗脫，間接取樣進行SDS-PAGE分析，收集含有單一目的蛋白的洗脫液進行脫鹽，用1×PBS(pH 7.2)緩沖液替換洗脫液中的咪唑，濃縮后通過BCA法測定其蛋白濃度。參照陳俊等[22]的方法對未經考馬斯亮藍染色的PAGE膠進行濕法轉膜，恒流116 mA條件下電轉40 min。Western-blot相關操作參照HU等[23]的方法，采用ECL顯色發光試劑盒對膜進行孵育，顯影儀自動曝光1 min，觀察免疫印跡結果。

1.3.6 酶活測定條件確定以及酶學性質分析

含前導肽的PG先用胰蛋白酶消化，消化試驗采用何燦等[24]的方法進行適當修改，具體如下：配制不同質量濃度的胰蛋白酶稀釋液(0.03、0.1、0.3、0.9、2.7 mg/mL)，與純化后的pro-mPG按1∶10混勻，消化不同時間(0～50 min，每間隔10 min)，進行SDS-PAGE分析和酶活力測定。根據SDS-PAGE條帶灰度分析和酶活力測定結果確定胰蛋白酶的最佳消化時間。

酶活力測定方法在汪正華等[15]的基礎上進行部分調整，將消化后的酶液與底物反應不同時間(0～30 min，每間隔5 min)，進行靛酚顯色，確定消化酶液與底物的最佳反應時間。根據酶活力結果，選擇以100 μL 酶液，用0.03 mg/mL胰蛋白消化10 min，底物反應時間20 min為酶活測定條件。

對純化的PG進行酶學性質分析，分別在不同pH(3.5～9.5)和不同溫度(25～70 ℃)下，將mPG孵育60 min后測定酶活力，探究PG的最適酶反應條件。

1.3.7 優化培養基配方和發酵產酶條件

以添加質量分數0.4%的谷氨酰胺[25]的LB培養基為基礎，選用不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、山梨糖醇、甘油)替代LB中80%酵母提取物，不同氮源(牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、安琪酵母粉、甘氨酸)替代LB中80%胰蛋白胨，分別添加質量分數為0.1%和0.3%的金屬離子(K+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+)[26]，探究不同碳、氮源和金屬離子對產酶的影響，并選擇不同的溫度(25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃)和不同的初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)分別培養重組菌，探究培養條件對產酶的影響。

1.3.8 數據分析

酶的純化及發酵條件優化等實驗均進行3次重復，采用prism統計軟件進行數據處理及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 目的片段的合成與重組載體的構建

由于產PG的解脘金黃桿菌與大腸BL21親緣關系較遠，為實現PG在BL21中的有效表達，本研究不使用編碼PG自身的信號肽[20,27]，而是利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pHT43及其本身含有的信號肽SamyQ構建重組質粒。圖1，為本研究構建的重組質粒pHT43：pro-mPG(P43)。

圖1 pHT43:pro-mPG(P43)重組質粒圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmidpHT43:pro-mPG(P43)

1.2 PG基因的克隆菌和重組表達菌的轉化及鑒定

將重組質粒轉化至Top10感受態細胞中，對質粒進行雙酶切驗證。結果如圖2-a所示，泳道1為重組質粒經MluI酶切后得到的片段，其片段大小與預期的7 288 bp和1 827 bp相符。將疑似陽性的重組質粒進行測序，與目的序列一致性為100%，證明成功構建了PG基因的克隆菌株。同理，提取Top10克隆菌株的重組質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞中，采用F2499/R3013引物對BL21轉化子進行菌液PCR驗證。結果如圖2-b所示，陽性轉化子PCR產物與陽性對照(重組質粒)條帶大小一致，在1 300 bp附近有單一的特異性擴增條帶，將PCR產物膠回收后并進行測序驗證，經BLAST比對結果顯示一致性為100%，證實PG重組表達菌株構建成功。

a-pHT43：pro-mPG(P43)質粒酶切b-陽性菌液PCR擴增產物a:M-1kbMarker，1-酶切后質粒，2-未切割質粒；b:M-100 bp Marker，1-陽性轉化子PCR產物，2-陽性對照圖2 pHT43：pro-mPG(P43)克隆及PCR驗證Fig.2 Verification ofpHT43:pro-mPG (P43) clone and recombinant transformant by PCR

1.3 pro-mPG的表達、純化及Western blot驗證

對菌體破碎上清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖3-a所示，35 kDa上方出現一條帶，與DNAMAN軟件預測的pro-mPG分子量37.54 kDa相符，可能為成功表達的可溶性pro-mPG。鎳柱純化的結果如圖3-b所示，結果表明，蛋白可以被鎳柱吸附，在20 mM的咪唑下可被洗脫，且能夠與鼠抗組氨酸標簽抗體特異性識別并產生免疫印跡，因此確認該蛋白為pro-mPG。

a-pro-mPG的表達及純化b-Western blot驗證圖a:1、2-重組菌全菌液，3-重組菌1的超聲破碎上清液，4～7-20 mmol/L咪唑洗脫液，8、9-250 mmol/L咪唑洗脫液；b:1、3-20 mmol/L咪唑洗脫液，2、4-250 mmol/L咪唑洗脫液，M-蛋白Marker圖3 菌體破碎液及鎳柱洗脫液中pro-mPG的SDS-PAGE圖及Western blot驗證Fig.3 SDS-PAGE image and Western blot verification of pro-mPG in the disrupted cells and elute from nickel column

1.4 pro-mPG的消化及其產物分析

pro-mPG經胰蛋白酶消化的結果如圖4-a 顯示，消化后出現兩條低分子量(約20、30 kDa)的條帶，與劉英杰報道的一致[28]。在消化時間0～50 min內，隨著反應的進行，pro-mPG逐漸由37.54 kDa降解到20 kDa，且20 kDa處的條帶在消化10 min后灰度最深。該蛋白疑似為切割掉前導肽后的成熟PG酶(mPG)。酶活力測定結果表明消化10 min的PG酶活力最高為0.250 U/mL。消化10 min后的酶液經鎳柱純化，得到單一條帶(圖4-b)，Western-blot分析發現該條帶同樣能與鼠抗His-tag產生特異性的免疫印跡反應，確認為mPG。

1.5 mPG的酶學性質分析

圖5-a為不同pH條件下測定純化mPG酶活力的結果，發現pH 6.5時，酶活最高。不同溫度下的PG酶活力結果如圖5-b所示，在45 ℃條件下出現最高酶活力。且隨著溫度的升高，酶活力呈現先上升后下降的趨勢，在70 ℃時幾乎喪失活性。

2.6 PG發酵條件優化

2.6.1 不同碳源、氮源對工程菌產酶的影響

對照組采用粗酶液進行測定，酶活力為0.417 U/mL，比純化的PG測得的酶活力高，這可能由于背景值較高以及谷氨酰胺添加的影響所致。由6-a可知，以蔗糖和麥芽糖為主要碳源的培養基產酶高于對照組，其中蔗糖組差異顯著(P<0.05)，最高酶活為0.490 U/mL，這可能是由于菌株對不同碳源的利用度不同導致產pro-mPG的量有差異。而以麥芽糖和淀粉為主要碳源的培養基對pro-mPG酶活力的影響不大，山梨糖醇和甘油對PG的酶活力的抑制作用顯著(P<0.05)。

a-胰蛋白酶消化pro-mPGb-消化產物Western blot分析a:M-蛋白Marker；1～6-胰蛋白酶消化不同時間(0、10、20、30、40、50 min)的pro-mPG；b:M-蛋白Marker 1、2-鎳柱純化后的mPG的SDS-PAGE圖，3、4-Western blot分析圖4 胰蛋白酶水解的pro-mPG的SDS-PAGE圖及Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE image and Western blot verification analysis of trypsin hydrolysis of pro-mPG

圖5 pH和溫度對PG酶活力的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on PG activity

在以蔗糖為主要碳源的培養基中，考察不同氮源對產酶的影響，結果如圖6-b所示，酵母浸粉對重組菌產酶影響顯著(P<0.05)，酶活在碳源優化的基礎上進一步提高至0.603 U/mL。

a-碳源; b-氮源圖6 不同碳源和氮源對工程菌產酶的影響Fig.6 Effect of different carbon and nitrogen sources on the pro-mPG production from engineering bacteria

2.6.2 金屬離子對工程菌產酶的影響

在上述最佳碳源和氮源的基礎上，考察不同濃度的金屬離子對產酶的影響。結果如圖7所示，添加Mn2+和Ca2+均對產酶有促進作用(P<0.05)，而K+、Ni2+和Mg2+對產酶的影響不顯著(P>0.05)，Cu2+和Fe2+的添加反而抑制了產酶。添加質量分數0.3%的Ca2+培養基最高酶活力為0.760 U/mL，與對照組相比，提高了0.157 U/mL左右。

圖7 不同金屬添加量對工程菌產酶的影響Fig.7 Effect of different metal additions on the production of pro-mPG from engineering bacteria

2.6.3 培養條件對pro-mPG酶活力的影響

25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃條件下工程菌產PG的酶活力分別為0.333 U/mL、0.481 U/mL、0.623 U/mL、0.764 U/mL、0.640 U/mL，37 ℃為最適溫度，如圖8-a所示。不同pH條件下測得的酶活力差異不顯著(P>0.05)，說明pH對工程菌產PG影響較小，如圖8-b所示。

圖8 溫度和pH對工程菌產酶的影響Fig.8 Effect of temperature and pH on the production of pro-mPG from engineering bacteria

3 討論

目前PG已作為國家批準的食品添加劑[29]，其生產來源仍然依賴解脘金黃桿菌[16]，但是該原始菌發酵產酶量少，限制了該酶的工業化生產應用。現有的工程菌過表達PG的研究，大多采用IPTG作為誘導劑[30]。但IPTG價格較昂貴，且對微生物和人體有一定毒性，故減少或避免其使用對食品酶的表達有重要的現實意義。因此，本研究采用強組成型啟動子P43代替pHT43本身的誘導型啟動子Pgrac，利用細菌的群體感應表達PG，不使用IPTG，提高了目標酶在食品中應用的安全性。

由于PG在植物蛋白脫酰胺方面有良好的應用前景，近年來，重組表達PG的相關研究已有一些進展，如汪正華等[15]誘導表達了包涵體形式的mPG，再經變性、復性處理后測得酶活力為0.371 U/mL。劉英杰[28]構建的pHT43-pp/Bacillussubtilis168和pHT43-pp/BacillussubtilisDB403，在IPTG誘導下均可表達mPG，最終在濃縮發酵胞外液中獲得約0.700 U/mL的酶活，其菌株產酶量為36.84 mg/mL。本文構建的表達菌株菌體上清液純化后質量濃度為181.68 μg/mL，根據濃縮倍數計算出發酵液中酶量為47.19 mg/mL，比上述報道高10.39 mg/mL。盡管產酶量有一定的提高，但未實現胞外的可溶性表達。另外，本實驗表達的酶仍需要通過外界酶進行加工，才可以釋放有活性的PG。因此，建立高效表達PG的體系是實現PG大規模商業化應用的基礎，也是今后的研究重點。

4 結論

本實驗采用強組成型啟動子P43與pro-mPG序列連接成功構建重組質粒pHT43：pro-mPG(P43)，通過化學轉化法成功獲得BL21陽性工程菌，經PCR和基因測序驗證正確。經Western blot驗證和酶活性測定，證明菌體在發酵生長對數后期可通過群體感應自誘導表達目的蛋白，避免了IPTG的使用。通過對LB培養基中碳源、氮源的替換以及金屬離子的添加，將酶活力由0.417 U/mL提高至0.761 U/mL。酶學性質研究表明，酶最適反應條件為45 ℃、pH 6.5。