蘋果酸-乳酸發(fā)酵細(xì)菌乙醇脅迫應(yīng)答機(jī)制研究進(jìn)展

蓋昱梓,孫靜嫻,黃剛,金剛

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 2 (寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 3(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)4 (寧夏葡萄與葡萄酒工程技術(shù)中心,寧夏 銀川,750021)

蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation,MLF)是指在葡萄酒釀造過程中,乳酸菌將L-蘋果酸分解生成L-乳酸和CO2的過程[1-3]。MLF對干紅葡萄酒和陳釀型白葡萄酒的口感、香氣及微生物穩(wěn)定性等的提升具有重要作用。MLF發(fā)生在酒精發(fā)酵結(jié)束后,此時葡萄酒中的乳酸菌受到高酒精度、低pH、高SO2等惡劣環(huán)境的脅迫。隨著全球氣候變暖的加劇,葡萄漿果的潛在酒度不斷升高[4]。酒精發(fā)酵完成后葡萄酒的高酒精度(可超過16%體積分?jǐn)?shù))成為很多產(chǎn)區(qū)葡萄酒能否順利進(jìn)行MLF的最重要因素之一[5]。乙醇脅迫環(huán)境下乳酸菌的脅迫應(yīng)答機(jī)制也越來越成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

在乙醇脅迫條件下,乳酸菌往往表現(xiàn)出細(xì)胞膜完整性受損、菌體關(guān)鍵酶活性下降和正常生理代謝調(diào)控異常等。同時,乳酸菌也會通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成、表達(dá)脅迫耐受相關(guān)基因和調(diào)整細(xì)胞生理代謝等作為應(yīng)對,進(jìn)而適應(yīng)乙醇脅迫的環(huán)境(圖1)。近年來,隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)和方法的不斷發(fā)展,人們對乙醇脅迫下乳酸菌應(yīng)答作用機(jī)制的研究逐漸深入。本文主要對MLF中酒球菌屬(Oenococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等常見菌屬細(xì)菌在乙醇脅迫下的應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了綜述。

圖1 乳酸菌乙醇脅迫適應(yīng)性機(jī)制圖Fig.1 Diagram of the adaptation mechanism of lactic acid bacteria to ethanol stress注:表示基因誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)

1 調(diào)節(jié)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜功能提高乙醇耐受性

細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為乳酸菌與乙醇環(huán)境接觸的屏障,直接影響著乳酸菌存活和MLF的順利進(jìn)行。特別是對于缺乏完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),直接由細(xì)胞膜包被的酒酒球菌(Oenococcusoeni),乙醇脅迫下的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)顯得尤為重要。

1.1 細(xì)胞膜功能調(diào)節(jié)提高乙醇耐受性

細(xì)胞膜作為細(xì)胞的界面和屏障，在細(xì)胞生長、代謝、能量傳導(dǎo)和維持穩(wěn)定的胞內(nèi)環(huán)境中起著重要作用[6]。乙醇的毒害作用往往首先作用于細(xì)胞膜，通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的疏水核心使極性分子自由地通過滲透屏障，影響細(xì)胞關(guān)鍵酶活性，致使細(xì)胞膜完整性受損，通透性及流動性增強(qiáng)，細(xì)胞生長受到抑制，甚至死亡[7]。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)是乳酸菌對乙醇脅迫的常見應(yīng)激防御機(jī)制。在受到乙醇脅迫后，細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成中不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)、飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)和環(huán)丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid，CFA)含量隨著乙醇脅迫濃度和時間發(fā)生變化[3, 8]。通常脅迫后，膜脂肪酸平均碳鏈得到延長，促使酰基鏈填充，減少游離酰基鏈末端的運(yùn)動，使其呈“凝膠狀”，從而保持細(xì)胞膜穩(wěn)定性[8]。乙醇脅迫后乳酸菌脂肪酸含量變化相關(guān)研究表明，盡管乙醇脅迫后植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌株WCFS1編碼脂肪酸生物合成(fab)基因簇表達(dá)下調(diào)，但編碼酰基載體蛋白合成酶的相關(guān)基因(acpS)和環(huán)丙烷脂肪酰基磷脂合成酶相關(guān)基因(cfa2)表達(dá)上調(diào)，通過促進(jìn)膜脂肪酸碳鏈的延長和CFA的合成，可抑制乳酸菌細(xì)胞流態(tài)化作用[9-10]。YANG等[11]在L.plantarum菌株NF92中鑒定到受acrR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的乙醇脅迫抗性基因fabZ1(3-羥基酰基-ACP脫水酶)，通過比較敲除和過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因acrR的研究表明，acrR通過正向調(diào)控脂肪酸生物合成(fab)基因簇促進(jìn)脂肪酸的生物合成，過表達(dá)acrR后細(xì)胞膜中UFA和CFA含量增加，特別是克服乙醇毒性效應(yīng)重要因子C18:1和cycC19:0，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動性，提高菌株對高濃度乙醇環(huán)境的適應(yīng)性。而O.oeni乙醇脅迫耐受相關(guān)研究同樣發(fā)現(xiàn)，在體積分?jǐn)?shù)為5%的低乙醇條件下菌株膜脂肪酸中SFA含量增加，在體積分?jǐn)?shù)為10%的高乙醇條件下UFA和CFA含量增加[12-13]。據(jù)報道，在高于體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇脅迫環(huán)境下，O.oeni中香葉基香葉基焦磷酸合酶基因(ggpps)表達(dá)水平顯著提高，通過促使類異戊二烯前體流向膜穩(wěn)定劑(如類胡蘿卜素途徑)相關(guān)合成，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，防止細(xì)胞死亡[14]。O.oeni和L.plantarum菌株乙醇脅迫后細(xì)胞膜調(diào)控機(jī)制的相似性，也是兩者在乙醇脅迫環(huán)境下菌株活性較高的重要原因。

1.2 細(xì)胞壁功能調(diào)節(jié)提高乙醇耐受性

由交替的N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸與一種或多種氨基酸短肽交聯(lián)而成三維網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)的肽聚糖(peptidoglycan,PG)是乳酸菌重要的細(xì)胞壁組分,以維持細(xì)胞形狀和防止?jié)B透脅迫而著稱[15-16]。YUAN等[17]將L.plantarum菌株利用Cre-lox重組技術(shù)在大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株中進(jìn)行基因整合構(gòu)建,鑒定插入為催化肽聚糖生物合成第1個重要步驟的編碼UDP-N-乙酰氨基葡糖烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移酶基因murA2及其上游基因間973 bp序列,使過表達(dá)菌株EC100乙醇耐受性較對照菌株提高4.1倍,證明乙醇脅迫下菌株murA基因表達(dá)能夠催化PG主要前體合成提高乙醇耐受性[17]。磷壁酸(teichoic acid,TA)是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的特殊組分,由甘油磷壁酸和核糖醇磷壁酸組成。轉(zhuǎn)錄組分析研究表明,L.plantarum菌株WCFS1在體積分?jǐn)?shù)為8%的乙醇脅迫初期磷壁酸D-丙氨酰化所需的dlt操縱子表達(dá)被誘導(dǎo),隨著脅迫時間延長,參與細(xì)胞壁磷壁酸生物合成的基因tagE5、tagE6轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào),菌株對乙醇環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng)[10]。除了表達(dá)細(xì)胞壁組分合成相關(guān)基因外,受乙醇脅迫影響,編碼具有自溶素活性的N-乙酰壁酰胺酶基因(oeoe0735、oeoe0588、oeoe1734)受到抑制表達(dá)下調(diào),防止細(xì)胞壁的自溶作用[18]。有趣的是,乳酸菌代謝在細(xì)胞壁外或細(xì)胞表面會造成酒體渾濁、增加葡萄酒黏稠感的胞外多糖(exopoly saccharides,EPS)合成,主要是由壓力環(huán)境所引起的[19]。乙醇脅迫環(huán)境下EPS合成相關(guān)的胞外多糖生物合成蛋白(oeoe0071)、UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(oeoe1737)等基因表達(dá)上調(diào),通過分解代謝途徑中一定量的葡萄糖產(chǎn)生EPS,構(gòu)成防止?jié)B透壓失調(diào)的保護(hù)因子,提高乳酸菌在葡萄酒中的存活率[20-21]。這也意味著乳酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的改變是克服乙醇在脂質(zhì)-水界面的影響所必需的。

2 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制和代謝變化提高細(xì)菌乙醇耐受性

除了調(diào)節(jié)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)維持細(xì)胞完整性外,乳酸菌往往通過細(xì)胞穩(wěn)態(tài)機(jī)制和代謝變化來對細(xì)胞內(nèi)部酸化和跨細(xì)胞膜質(zhì)子梯度消散、活性氧積累等乙醇脅迫影響做出應(yīng)對,表現(xiàn)出增強(qiáng)乙醇抗性的細(xì)胞狀態(tài)[22]。

2.1 質(zhì)膜結(jié)合ATP酶的激活提高乙醇耐受性

隨著乙醇濃度的增加,乳酸菌中質(zhì)膜結(jié)合ATP酶激活表達(dá),特別是質(zhì)膜結(jié)合ATP酶中的H+-FoF1-ATP酶,不僅參與細(xì)胞內(nèi)ATP的合成,還與ATP水解偶聯(lián),將質(zhì)子從細(xì)胞中擠出到可產(chǎn)生質(zhì)子梯度的介質(zhì)中,產(chǎn)生質(zhì)子驅(qū)動力(proton motive force,PMF)施加到質(zhì)子上,驅(qū)動需要膜結(jié)合過程的代謝。全基因組分析表明,乳酸菌中普遍存在FoF1-ATP酶基因,這對于乙醇脅迫下乳酸菌存活能量供應(yīng)而言至關(guān)重要[23-24]。CONTRERAS等[25]在體積分?jǐn)?shù)分別為9%和12%的乙醇培養(yǎng)環(huán)境下將O.oeni菌株P(guān)SU-1和無乙醇脅迫條件進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),由FoF1-ATP酶滿足的非生長相關(guān)維持性ATP需求分別提高了10倍和17倍,幫助表達(dá)細(xì)胞維持相關(guān)代謝[25]。除了H+-ATP酶外,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶也是分布在細(xì)胞膜上的典型巰基酶。因乙醇脅迫而消除的Na+-K+、Ca2+-Mg2+巰基會導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加,因此較高的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性對菌株乙醇菌株脅迫耐受是非常有益的[26-28]。LIN等[29]將O.oeni菌株SD-2a的puuE基因在L.plantarum菌株WCFS1中進(jìn)行異源表達(dá),證明puuE基因可以顯著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,從而提高細(xì)胞膜完整性,在細(xì)菌乙醇耐受性中發(fā)揮作用。

2.2 蘋果酸和檸檬酸代謝調(diào)控提高乙醇耐受性

目前已經(jīng)報道的O.oeni部分蛋白質(zhì)組脅迫應(yīng)激反應(yīng)和代謝機(jī)制表明,乳酸菌蘋果酸代謝和檸檬酸代謝能夠消耗質(zhì)子,并產(chǎn)生膜電位和pH梯度,在乙醇脅迫環(huán)境為菌株能量供應(yīng)和細(xì)胞體內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[30-31]。

在葡萄酒中乳酸菌可以攝取環(huán)境內(nèi)的蘋果酸和檸檬酸參與相關(guān)代謝。蘋果酸代謝將L-蘋果酸脫羧為L-乳酸和CO2。脫羧過程中質(zhì)子被消耗,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)部pH,從而保持質(zhì)子電位梯度,并在細(xì)胞質(zhì)膜上形成PMF,通過膜結(jié)合的FoF1-ATP酶驅(qū)動ATP合成,提高乙醇脅迫下菌株存活率[31]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,乙醇脅迫下與蘋果酸代謝相關(guān)mle操縱子(mleA、mleP、mleR)、MLF系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活因子(oeoe1565)轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào),幫助細(xì)菌應(yīng)對乙醇脅迫[21]。而葡萄酒中檸檬酸由各種膜相關(guān)通透酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后,檸檬酸鹽在檸檬酸裂解酶復(fù)合物催化下轉(zhuǎn)化為乙酸鹽和草酰乙酸鹽；然后由草酰乙酸脫羧酶脫羧,最終生成丙酮酸和CO2,或被可溶性細(xì)胞質(zhì)蘋果酸酶脫羧,從環(huán)境中獲得能量,并且產(chǎn)生雙乙酰等香氣化合物[32]。值得注意的是,菌株檸檬酸相關(guān)基因表達(dá)水平可能主要受培養(yǎng)環(huán)境檸檬酸誘導(dǎo)[21，33]。有研究將O.oeni菌株P(guān)SU-1在額外添加0.5 g/L檸檬酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng),結(jié)果表明檸檬酸代謝激活主要受乙醇影響,當(dāng)存在乙醇時,檸檬酸途徑的基因操縱子cit(citC、citD、citE、citF)表達(dá)激活,響應(yīng)乙醇脅迫代謝產(chǎn)物雙乙酰、乙酸的相關(guān)基因alsD和ackA的表達(dá)量增加,通過利用培養(yǎng)基中檸檬酸鹽進(jìn)行代謝[33]。而將O.oeni菌株Elios在不含檸檬酸的體積分?jǐn)?shù)為8%的乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,則發(fā)現(xiàn)檸檬酸操縱子(編碼檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因oeoe0419和編碼檸檬酸裂解酶α亞基oeoe0423)表達(dá)下調(diào),并且在蛋白質(zhì)水平上得到一致結(jié)果[21]。

2.3 氨基酸代謝調(diào)控提高乙醇耐受性

氨基酸代謝是乳酸菌應(yīng)對乙醇脅迫的又一重要途徑。在乳酸菌中,精氨酸通過脫亞氨酶途徑完全降解為鳥氨酸、NH3和CO2,提供一分子ATP,維持細(xì)胞內(nèi)部pH動態(tài)平衡。研究表明,乳酸菌生長初期編碼精氨酸脫亞氨酶(ArcA)、鳥氨酸氨基甲酰基轉(zhuǎn)移酶(ArcB)和氨基甲酸酯激酶(ArcC)關(guān)鍵酶基因的arc操縱子由碳分解代謝控制蛋白(CcpA)負(fù)調(diào)控；隨著菌株生長(指數(shù)生長期或穩(wěn)定生長期),arc操縱子表達(dá)由轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子argR、ahrC調(diào)節(jié)[34]。在表達(dá)arc操縱子的乳酸菌中,精氨酸分解代謝可以為乳酸菌適應(yīng)乙醇環(huán)境和生長提供能量。DEZ等[35]將乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株NZ9700在外源添加精氨酸的乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)與正常株相比argR、ahrC基因敲除株生長速率下降,進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),乙醇存在下正常株參與精氨酸降解的arcA、arcB、arcD1等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)20～40倍。精氨酸合成前體之一的谷氨酸在乙醇脅迫應(yīng)答中同樣具有重要作用[36-38]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究結(jié)果表明,體積分?jǐn)?shù)為8%的乙醇脅迫后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(oeoe1634)的生物合成表達(dá)增加,通過脫羧生成γ-氨基丁酸以及谷氨酸-γ-丁酸逆向系統(tǒng)在環(huán)境中擠出γ-氨基丁酸作為質(zhì)子動力,幫助菌株維持胞內(nèi)pH動態(tài)平衡，增加潛在能源可用性[21,39]。

圖2 乙醇環(huán)境下谷胱甘肽代謝途徑[40]Fig.2 Glutathione metabolism pathway in ethanol environment[40]注：Gpo,谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)；GSH,還原型谷胱甘肽(glutathione)；GSSG,氧化型谷胱甘肽 (glutathione disulfifide)；GshR,谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase)；Grx,谷氧還蛋白(glutaredoxin)

3 應(yīng)激蛋白合成提高乙醇耐受性

當(dāng)乳酸菌生存環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖济{迫環(huán)境后,蛋白質(zhì)表達(dá)由抑制冗余或非必需蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣捎糜诘钟{迫環(huán)境的應(yīng)激蛋白,參與細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的重組修復(fù)。乙醇脅迫后乳酸菌開始誘導(dǎo)應(yīng)激蛋白特別是熱激蛋白(heat shock protein,HSP)表達(dá)。

HSP是較早發(fā)現(xiàn)的一類應(yīng)激蛋白質(zhì),屬于分子伴侶蛋白質(zhì)。在多種脅迫環(huán)境下,HSP都能夠阻止蛋白質(zhì)聚集,并協(xié)助蛋白質(zhì)重新折疊,最終發(fā)揮防止蛋白質(zhì)損傷和提高脅迫耐受性的分子伴侶作用[44]。常見的HSP主要包括分子伴侶蛋白(DnaK、GroESL、DnaJ等)、蛋白酶(Clp、FstH、HtrA等)以及DNA重組修復(fù)蛋白(RecA、UvrD解旋酶等)[45]。目前由阻遏蛋白HrcA、CtsR單一或共同調(diào)控的DnaK和GroESL較多報道與乳酸菌乙醇脅迫響應(yīng)相關(guān)。在O.oeni中ctsR基因被鑒定并且異源表達(dá)驗(yàn)證為逆境反應(yīng)基因重要表達(dá)調(diào)控因子,通過調(diào)控hsp18、clp等小熱休克蛋白基因表達(dá),例如,O.oeni中的hsp18基因合成的Lo18蛋白,對乙醇等脅迫環(huán)境做出對應(yīng)[46-47]。ZHAO等[48]將O.oeni中ctsR基因在L.plantarum菌株WCFS1中異源表達(dá),結(jié)果表明菌株WCFS1在酸性乙醇環(huán)境下的生長性能得到提高,操縱子下游clp、groESL、dnaK和hsp等基因表達(dá)增強(qiáng)。L.plantarum菌株WCFS1在乙醇環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),受到乙醇環(huán)境影響后菌株蛋白質(zhì)快速連續(xù)展開,僅僅由hrcA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的groELS逐漸不足以維持蛋白質(zhì)的正確折疊,變性和聚集的蛋白質(zhì)積累到一定程度后,ctsR調(diào)節(jié)子開始激活clpP、clpE、hsp18等轉(zhuǎn)錄表達(dá),維持正常蛋白質(zhì)功能[10,49]。HSP中DNA修復(fù)蛋白通常在細(xì)胞體內(nèi)外多種因素脅迫時被激活,對受損DNA進(jìn)行識別和修復(fù)。在同為革蘭氏陽性菌的簡單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)菌株TCCC11037乙醇脅迫報道發(fā)現(xiàn),DNA重組修復(fù)過程中關(guān)鍵蛋白基因recA和uvrD轉(zhuǎn)錄表達(dá)分別提高了2.59倍和2.57倍[50]。而在葡萄酒釀造常見乳酸菌中雖然同樣存在DNA修復(fù)蛋白,但是乙醇脅迫表達(dá)變化研究中卻鮮見報道。關(guān)于乙醇脅迫后葡萄酒釀造常見乳酸菌DNA修復(fù)蛋白表達(dá)相關(guān)機(jī)制可能仍需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

對乳酸菌在乙醇脅迫環(huán)境下的應(yīng)答機(jī)制研究,不僅有助于更好地了解相關(guān)菌種特性,而且為優(yōu)良菌株構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。目前,研究人員主要從維持細(xì)胞完整性、細(xì)胞內(nèi)部能量供應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)、脅迫蛋白表達(dá)等方面對乳酸菌乙醇脅迫應(yīng)答和適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行了研究,以了解葡萄酒中乳酸菌的乙醇脅迫適應(yīng)性表達(dá)機(jī)制。然而實(shí)際上葡萄酒是多脅迫共存的復(fù)雜環(huán)境,因此如果能夠進(jìn)一步認(rèn)識乳酸菌多脅迫因素條件下細(xì)胞代謝的內(nèi)在聯(lián)系和交叉保護(hù)機(jī)制,將對全面認(rèn)識乳酸菌的逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制和更好發(fā)揮乳酸菌在葡萄酒MLF中的作用具有重要意義。相信隨著新技術(shù)的發(fā)展,人們對葡萄酒脅迫環(huán)境中脅迫應(yīng)答機(jī)制的深入研究,乳酸菌脅迫應(yīng)答適應(yīng)性機(jī)制將得到更全面地揭示。