基于核酸適配體結合納米金模擬酶用于單增李斯特菌的快速檢測

陳威風,陳薇,蔡穎,崔麗偉,郝修震*,王小紅

1(河南牧業經濟學院,河南 鄭州,450046) 2(華中農業大學 食品科學技術學院,湖北 武漢,430070)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是一種能夠引起人類、家畜共患病的食源性致病菌，具有較強的致病性并廣泛分布于人類生存環境中,如土壤、植物、水、乳制品、肉制品、蔬菜制品等。免疫力低下人群(嬰幼兒、孕婦、中老年人)容易接觸并感染,進而引起嘔吐、腦膜炎、孕婦流產、敗血病等癥狀,致死率高達30%[1-3]。單核細胞增生李斯特氏菌在較低的溫度下也能正常生長,從而增加了感染食品的機會,其危害對于冷凍食品而言較為突出[4-5]。單增李斯特菌可形成生物膜,在食品加工設施表面定居,也能在強酸強堿環境中生存。此外,土壤中的單增李斯特菌是一種腐生菌,以腐爛的有機物為食,同時也增加了果蔬污染的風險[6]。

目前,我國食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測主要采用分離和培養方法,并結合相關的顯色介質,但存在操作復雜,實驗周期長等問題[7]。近年來,基于抗體的免疫學方法[8-9]、PCR[10-11]、LAMP[12-13]和分析MIC模式的VITEK2系統[14]方法等已經建立,但都具有局限性?？贵w、ELISA試劑盒和RT-PCR試劑昂貴,缺乏成本效益,而VITEK2系統既復雜又耗時。因此,迫切需要開發更簡單、快速的方法用于單增李斯特菌的檢測。

核酸適配體是在體外合成得到的一小段DNA或RNA鏈。近年來,許多目標物的適配體通過指數富集配體系統進化技術在體外進行多輪篩選、擴增、富集得到[15-16],是一個相對穩定、分子質量小的化合物,易于修飾,可在體外無限合成,具有高特異性和強親和力等優點?；谠搩烖c,核酸適配體得到了快速發展,在食品檢測中應用廣泛,如沙門氏菌[17]、黃曲霉毒素[18]、重金屬離子[19]和瘦肉精[20]等的檢測。本文根據適配體的高度特異性,利用適配體與目標物、納米金(gold nanoperticle,AuNPS)的相互作用及納米酶催化過氧化氫氧化3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)發生顏色反應,建立單增李斯特菌快速檢測方法,并對方法的準確度、精密度進行評定,為單增李斯特菌快速測定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品,當地超市;TMB,鄭州萊寶實驗器材科技有限公司；過氧化氫(H2O2)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、氯金酸,國藥集團化學試劑有限公司;所用實驗試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。單增李斯特菌序列：5′-ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAG-GGCGGGTACCCGG-3′[21]

1.2 儀器與設備

BlueStar B紫外-可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器股份有限公司；AE224電子分析天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ULUP-I-10T超純水儀,四川優普超純科技有限公司。

1.3 AuNPS的合成

采用氧化還原反應，利用檸檬酸鹽還原氯金酸的方法制備AuNPS[22-23]。向250 mL的三口燒瓶中加入98 mL超純水和1 mL 10 g/L氯金酸溶液,于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上,設置溫度為120 ℃,加熱至沸騰后,向圓底燒瓶中迅速加入1 mL 10 g/L檸檬酸鈉溶液,觀察溶液顏色由淡黃色到灰黑色至紫紅色最后變為酒紅色,繼續攪拌,保持溶液沸騰15 min。停止加熱,繼續攪拌冷卻至室溫,將制備的AuNPs溶液于4 ℃冰箱貯存備用。

1.4 單增李斯特菌的檢測過程

向反應體系中先加入30 μL 1.0 μmol/L單增李斯特菌適配體和20 μL不同濃度的菌液充分混合15 min,然后加入50 μL的AuNPs溶液,充分混合振蕩15 min后,加入20 μL 50 μg/mL的CTAB溶液,繼續振蕩15 min,隨后分別加入60 μL具有還原性的模擬酶底物TMB 和20 μL體積分數為30%的H2O2溶液,在37 ℃培養箱中充分反應45 min后,肉眼觀察顏色變化并對其在450～750 nm范圍內進行吸光度掃描,記錄其在最大吸收波長650 nm處的吸光值,并計算各個L.monocytogenes濃度下吸光度的差值(ΔA=A0-ALM,A0為溶液中不添加L.monocytogenes時的吸光度值,ALM為溶液中添加LM時的吸光度值)。

1.5 實際樣品測定

為驗證該檢測體系在食品中應用的可行性,稱取25 g豬肉樣品,配制3個連續稀釋度(2.6×102、2.6×103和2.6×104CFU/mL)的單增李斯特菌菌液,吸取1 mL加入至豬肉樣品中拍打均勻,放入盛有225 mL的無菌生理鹽水的均質袋中,用均質機拍打1～2 min,混勻。根據已建立的檢測方法,加入反應體系中進行檢測,同時倒平板涂布,至37 ℃培養箱培養18～24 h,驗證平板培養計數結果,計算回收率。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜表征

利用紫外-可見分光光度計對比色法檢測L.monocytogenes的可行性進行考察。在反應體系中不添加H2O2和TMB,研究AuNPS在反應過程中的分散狀態,結果如圖1-a所示。對比曲線a、c可知,測定體系中無CTAB時,AuNPs顆粒具有較強的表面等離子共振特性,在溶液中呈現分散狀態,呈紅色,520 nm處有吸收峰,證明單增李斯特菌的存在不影響溶液狀態的變化；當加入CTAB后,吸收峰從520 nm移至740 nm(曲線b),顏色呈淺藍色,證明此時AuNPs顆粒發生了聚集；加入適配體后溶液顏色變為紅色,在520 nm處重新出現吸收峰(曲線d),說明此時AuNPs顆粒重新呈現分散狀態；而加入L.monocytogenes后,740 nm又重新出現了吸收峰(曲線e),顏色又變為淺藍色,這說明AuNPs顆粒又發生了聚集。在反應體系中加入H2O2和TMB,研究單增李斯特菌濃度與反應體系顏色變化的關系,如圖1-b所示,AuNPs可催化H2O2氧化TMB出現藍色,在650 nm處有吸收峰(曲線a),對比曲線a和b可以看出單增李斯特菌適配體可以增強AuNPs催化能力,催化溶液顯示深藍色。對比曲線a和c可看出CTAB可誘導AuNPs發生聚集,在650 nm處吸光度降低,溶液呈現淺藍色。對比曲線d和e發現,當反應體系存在L.monocytogenes時,溶液顏色變淺,吸光度值下降,這是由于L.monocytogenes與適配體特異性結合,AuNPS失去了適配體的“保護”作用,催化能力降低。此外,在無TMB(曲線f)或無AuNPs(曲線g)情況下,均不產生催化反應,溶液呈無色,實驗結果與上述結論一致。

a-不添加H2O2和TMB的反應體系;b-添加H2O2和TMB的反應體系圖1 不同條件下反應溶液的吸收光圖譜Fig.1 The absorption spectra of the reaction solution under different conditions

2.2 實驗條件優化

為了提高準確度和靈敏度,在單增李斯特菌濃度為1.47×104CFU/mL時對實驗條件進行優化。本實驗對溶液中單增李斯特菌適配體濃度、CTAB質量濃度、TMB用量、H2O2用量和反應時間進行優化,探討不同條件下吸光度差值的變化,尋求最佳實驗條件。

當DNA適配體濃度過低時,DNA適配體不能完全阻止CTAB對AuNPs模擬酶活性的團聚作用,而當DNA適配體濃度過高時,DNA適配體會與L.monocytogenes特異性結合,未結合完的DNA適配體會與CTAB作用,從而減小了CTAB對AuNPs的團聚作用,故本實驗選擇1.0 μmol/L為最佳的DNA適配體濃度(圖2-a)。由圖2-b可知,CTAB最佳質量濃度為50 μg/mL,這可能是由于CTAB質量濃度過低時,其對AuNPs的團聚作用較小,而過高時,適配體的加入不足以改變CTAB對AuNPs的作用力,使檢測體系的靈敏度下降。TMB和H2O2用量直接影響反應體系的氧化程度,從而導致吸光度值的變化,影響測定靈敏度。根據實驗結果(圖2-b、圖2-d),選擇TMB和H2O2的最佳用量分別為為60 μL和20 μL。如圖2-e所示,隨著反應時間的增加,吸光度差值呈現先增后降的趨勢,故本實驗選擇45 min為最佳反應時間。

a-適配體濃度;b-CTAB質量濃度;c-TMB用量;d-H2O2用量;e-反應時間圖2 實驗條件的優化Fig.2 Optimization of experimental conditions

2.3 線性范圍與檢出限

隨著單增李斯特菌濃度的不斷增高,最大吸收值不斷降低,溶液顏色依次變淺；以最大吸收波長處吸光度變化值為縱坐標,L.monocytogenes濃度對數為橫坐標,繪制相關性曲線,如圖3所示,線性方程為y=0.032 1x+0.024 8,R2=0.996 3,檢出限約為5 CFU/mL。與傳統培養法相比,該可視化檢測體系對單增李斯特菌有較靈敏的檢出限,檢測時間為1.5 h,在檢測時間和操作程序方面有絕對優勢。與GRADY等[24]基于 RT-PCR 建立的單增李斯特菌檢測方法相比,檢出時間更短,而且不依賴昂貴的儀器,就可實現可視化檢測。與LIU[25]開發的基于表面增強拉曼散射結合重組酶聚合酶擴增檢測單增李斯特菌的方法相比,檢測時間更短,檢出限更低,而且不需要繁瑣的操作步驟。

a-光譜圖;b-校準曲線圖3 不同濃度的L.monocytogenes吸收光譜圖和校準曲線Fig.3 The absorption spectra of L.monocytogenes with different concentrations and the calibration curve

2.4 特異性研究

為了驗證可視化檢測L.monocytogenes的特異性,在最佳條件下,將不同濃度的L.monocytogenes菌液分別替換成濃度為1.47×103CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液Staphylococcusaureus、沙門氏菌菌液Salmonella、福氏志賀菌菌液Shigellaflexneri、大腸桿菌菌液Escherichiacoli和枯草芽孢桿菌菌液Bacillussubtilis進行特異性實驗。由圖4可知,當L.monocytogenes存在時,適配體會與其特異性結合,溶液的吸光度值明顯低于其他5種菌在反應體系溶液中的吸光度值,表明所建立的方法特異性較好。

圖4 可視化檢測L.monocytogenes的特異性分析Fig.4 Visualization specificity analysis of L.monocytogenes

2.5 實際樣品檢測

為驗證該檢測體系在食品中應用的可行性,本實驗選取豬肉樣品進行驗證,結果如表1所示,樣品回收率為93.5%～105.4%,由此表明所建方法可以實現對單增李斯特菌進行準確、快速測定。

表1 豬肉樣品中單增李斯特菌的檢測Table 1 Detection of L.monocytogenes in pork samples

3 結論

本實驗以金納米粒子作為比色探針,以核酸適配體為生物識別元件,構建了一種靈敏度高、特異性強的可視化快速檢測方法。在最佳實驗條件下,建立了可視化檢測L.monocytogenes的快速定量標準曲線,線性方程為y=0.032 1x+0.024 8(R2=0.996 3),檢出限約為5 CFU/mL。加標回收率為93.5%～105.4%,標準偏差小于10%。所建方法操作簡單,可在2 h內根據溶液顏色變化實現對單增李斯特菌的快速檢測,結果準確可靠。