不同蛋白酶制備藜麥麩皮多肽及其活性研究

林冰潔,薛鵬,2,荊金金,張若愚,季曉迎,韓彩靜,2*,張豐香,2*

1(濰坊醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院,山東 濰坊,261053)2(濰坊市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濰坊,261053)

藜麥?zhǔn)?年生藜科雙子葉植物,富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素以及多酚、黃酮、皂苷等植物化學(xué)成分，被國際營養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“超級谷物”、“營養(yǎng)黃金”和“未來食品”[1]。長期食用具有增強(qiáng)耐力、降血糖、降血脂、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病等功效[2]。近年來,藜麥的生物活性逐漸成為研究的熱點(diǎn),而藜麥蛋白及其多肽的生物活性是研究熱點(diǎn)之一。

藜麥多肽具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓和抗癌等活性[3]。范三紅等[4]用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對藜麥糠進(jìn)行酶解,利用超濾技術(shù)分離純化藜麥糠抗氧化肽,表明分子質(zhì)量為5 k～10 ku 的抗氧化肽較其他分子質(zhì)量的抗氧化活性好。NONGONIERMA等[5]采用木瓜蛋白酶對藜麥蛋白進(jìn)行酶解得到具有降血糖活性的肽。葉凱等[6]用胰蛋白酶酶解得到的藜麥多肽對α-淀粉酶抑制率最好(45.54%),可作為糖尿病患者的藥用添加劑。VILCACUNDO等[7]研究發(fā)現(xiàn)了17種藜麥多肽具有較高的抗癌能力并對3種不同細(xì)胞(Caco-2、HT-29、HCT-116)抑制率進(jìn)行測定,當(dāng)肽分子質(zhì)量>5 ku時(shí)對結(jié)腸癌的抑制率明顯高于其他肽分子質(zhì)量。REN等[8]分離到的藜麥lunasin肽,在質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)對NO、TNF-α和Interlenukin-6的抑制率分別為44.77%、39.81%和33.50%,具有較強(qiáng)的體外消炎能力。ALUKO等[9]用堿性蛋白酶酶解藜麥蛋白，經(jīng)超濾膜過濾得到IC50值分別為0.075、0.015和0.030 mg/mL的多肽,均表明藜麥多肽具有降血壓活性。

藜麥的食用過程與小麥等類似,加工過程會(huì)產(chǎn)生大量麩皮,其富含蛋白且營養(yǎng)豐富,但都作為飼料或被丟棄,沒有被深入的開發(fā)利用,造成極大浪費(fèi)[10]。目前,藜麥蛋白多肽的提取工藝多采用堿溶酸沉法提取蛋白,然后進(jìn)行酶水解[5]。本研究采用2次醇沉工藝可同時(shí)得到多糖和多肽,提高了藜麥麩皮的利用率。本文以第一次醇沉得到的粗蛋白為原料,研究了不同蛋白酶對所提藜麥麩皮蛋白的酶解能力以及經(jīng)不同蛋白酶酶解后多肽的活性,為藜麥麩皮的開發(fā)提供理論依據(jù),也為后續(xù)探討藜麥麩皮多肽的活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮,山西省靜樂縣山西億隆；牛血清蛋白、菲咯嗪(ferrozine)、酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶、多巴(levodopa,L-DOPA)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),Sigma 公司；中性蛋白酶Neutrase 1.5 MG、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme 500 MG、堿性蛋白酶Alcalase 3.0 T、復(fù)合蛋白酶Protamex,諾維信生物技術(shù)有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、4-硝基苯基-α-D-呲喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,PNPG)、阿卡波糖、抗壞血酸,北京索萊寶科技有限公司；福林酚試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī)(3-16KL),德國 Sigma 公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE),昆山市超聲儀器有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀(K9840),濟(jì)南海能儀器股份有限公司；臺(tái)式酸度計(jì)(FE28),梅特勒-托利多集團(tuán)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(K101-1BS),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-5100B),上海元析儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SB-1300),日本EYELA 公司；酶標(biāo)儀(Thermo1510),美國賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機(jī)(FDU-2110),日本EYELA 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥麩皮多肽制備工藝流程

藜麥麩皮蛋白多肽的提取按照圖1進(jìn)行。

圖1 藜麥麩皮多肽制備工藝流程圖Fig.1 Process flow chart for preparation of quinoa husk peptides

1.3.2 藜麥麩皮蛋白分子質(zhì)量的分布及氨基酸組成測定

稱取30 g藜麥麩皮于燒杯中,按照料液比1∶15(g∶mL)加入蒸餾水,超聲45 min后于4 000 r/min離心10 min,收集上清液旋蒸后加入無水乙醇溶液,使混合液乙醇的體積分?jǐn)?shù)在75%～80%維持30 min以除去小分子物質(zhì),5 000 r/min離心30 min取沉淀,乙醇揮發(fā)后根據(jù)下列方法測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成和分子質(zhì)量分布。

氨基酸測定：根據(jù) GB 5009.124—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》。

分子質(zhì)量分布：參考姜燕蓉等[11]的方法對藜麥麩皮蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SPS-PAGE)測定。

1.3.3 藜麥麩皮多肽的制備

取1.3.2小節(jié)的沉淀按照料液比為1∶10(g∶mL)的比例加入蒸餾水,攪拌均勻后用0.05 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至酶最適pH后,加入蛋白酶[E]/[S](3 000 U/g),在最適條件(表1)下酶解3 h,期間用0.05 mol/L NaOH溶液維持反應(yīng)體系的pH。

表1 藜麥麩皮蛋白酶解工藝參數(shù)Table 1 Technological parameters of enzymatic hydrolysis of quinoa husk protein

將酶解液旋蒸濃縮后加入無水乙醇溶液,使乙醇的體積分?jǐn)?shù)在75%～80%并靜置30 min后,5 000 r/min下離心30 min取上清液,旋蒸濃縮后冷凍干燥獲得粗多肽粉末。

1.3.4 蛋白水解度的測定

在中性及堿性條件下采用 pH-stat 法計(jì)算蛋白水解度[12]。

1.3.5 肽得率的計(jì)算

多肽含量測定方法采用福林酚法,蛋白質(zhì)含量根據(jù) GB/T 5009.5—2016 中的凱氏定氮法測定。藜麥麩皮多肽得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.4 多肽活性測定

將上述粗多肽采用DA201-C大孔吸附樹脂脫鹽后,用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗脫,除去乙醇,冷凍干燥,用于活性測定。

1.4.1 多肽α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

參照沈佳奇等[13]的方法,稍作調(diào)整。實(shí)驗(yàn)分為空白、對照、樣品空白和樣品組,在96孔板中依次加入PBS緩沖液、抑制劑溶液和2.5 mmol/L PNPG底物溶液,充分混合后于37 ℃水浴10 min,取出96孔板在樣品組中加入0.3 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液充分混勻后于37 ℃水浴20 min,然后加150 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng),每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。用酶標(biāo)儀測量405 nm處的吸光度值,根據(jù)公式(2)計(jì)算各樣品的α-葡萄糖苷酶抑制率:

(2)

式中：AC,對照組；AB,空白組；AS,樣品組；ASB,樣品空白組。

1.4.2 酪氨酸酶抑制率的測定

稱量不同蛋白酶酶解的多肽并配制成1、5、10和20 mg/mL的樣品溶液。按表2的劑量在96孔板中依次加入藥品,最后加入酪氨酸酶溶液,搖勻,置于25 ℃恒溫反應(yīng)20 min[14]。用酶標(biāo)儀測量475 nm處的吸光度值,以抗壞血酸為陽性對照,每組試驗(yàn)3個(gè)平行,按照按公式(3)計(jì)算酪氨酸酶抑制率：

(3)

表2 反應(yīng)物添加劑量 單位：μL

1.4.3 Fe2+螯合率的測定

根據(jù)DECKER等[15]的方法改進(jìn)。取1 mL樣品溶液于試管,滴加0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液并用蒸餾水定容至1.90 mL,混合均勻后,再滴加0.1 mL 5 mmol/L菲咯嗪試劑,充分振蕩混合后室溫靜置10 min,于波長562 nm處測定吸光度,每組試驗(yàn)3個(gè)平行。Fe2+螯合率按公式(4)計(jì)算：

(4)

1.4.4 DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)置 3 次平行,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,利用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著,采用GraphPad Prism 8.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥麩皮蛋白分子質(zhì)量分布

對多肽提取工藝中第一次醇沉的蛋白通過12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分析,如圖2所示。藜麥麩皮蛋白電泳圖譜共分離出3條蛋白亞基帶,根據(jù)位移標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知條帶主要分布在22.8 k、39.1 k、52.7 kDa。RUIZ等[17]采用堿溶酸沉法對藜麥種子進(jìn)行蛋白提取,測定在不同堿性條件下提取的蛋白分子質(zhì)量分布,主要條帶為6 k、33 k、38和50 kDa。在堿溶酸沉提取中,隨著提取pH值增加,高、中分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶會(huì)較暗,因其在較高提取pH值下,蛋白質(zhì)被水解成較低分子質(zhì)量的蛋白,并通過增加的疏水相互作用和分子間二硫鍵結(jié)合成不溶性聚集體,這些聚集體在進(jìn)行電泳前通過離心去除,低分子質(zhì)量的蛋白會(huì)更容易被提取[18]。藜麥分離出的蛋白主要由11S球蛋白和2S白蛋白(分子質(zhì)量主要由8 k～9 kDa的多肽組成),本研究在提取蛋白時(shí)沒有采用堿溶酸沉法并未在較高pH值條件下提取,因此分離出來的主要是11S球蛋白,不存在較低分子質(zhì)量的蛋白。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；S-藜麥麩皮蛋白圖2 藜麥麩皮蛋白電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of quinoa husk protein

2.2 藜麥麩皮蛋白氨基酸組成

從營養(yǎng)學(xué)角度看,食物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量與其所含有氨基酸的種類和含量有關(guān)。由表3可知,藜麥麩皮蛋白中必須氨基酸占35.17%,接近FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的40%,因此藜麥蛋白可為氨基酸比例均衡的理想蛋白。

表3 藜麥麩皮蛋白氨基酸組成 單位：g/100 g

相關(guān)研究表明,從蛋白質(zhì)中提取出的疏水性氨基酸的含量,氨基酸組成和肽序列中獨(dú)特的氨基酸位置對生物活性有很大影響。疏水性氨基酸殘基位于細(xì)胞間和C端,對抗氧化活性有重要影響且含有大量疏水氨基酸的多肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性[19]。除此之外,疏水性氨基酸殘基(如丙氨酸)還可提高酪氨酸酶抑制活性,并且丙氨酸還顯示出阻斷黑素生成的能力。含硫氨基酸(Met、Cys)還可以促進(jìn)機(jī)體和腸道黏膜的生長發(fā)育,并增強(qiáng)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。由表3可知,疏水性氨基酸占總氨基酸比例約1/3,含量較高,因此可以推斷藜麥麩皮蛋白具有多種生物活性。

2.3 不同蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的水解

將藜麥麩皮蛋白溶液分別用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶按照表1的條件進(jìn)行水解,酶與底物濃度比[E]/[S](3 000 U/g),酶解時(shí)間均為3 h。在酶解過程中水解度至關(guān)重要,因其反映蛋白質(zhì)對底物的酶解能力,包括游離氨基酸和所得肽的分子質(zhì)量。不同蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的水解度如圖3所示,總的來說,隨著酶解時(shí)間增加,水解度增加。在所有蛋白酶中,堿性蛋白酶的水解程度最好,在120 min時(shí)水解度達(dá)到13%,其次為中性蛋白酶,復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解度基本一致。

圖3 不同蛋白酶的水解進(jìn)程Fig.3 Hydrolysis process of different proteases

水解度越大,酶解越徹底,水解物中所含的小分子蛋白越多,多肽提取率就越高。由圖4可知,堿性蛋白酶酶解后的多肽得率達(dá)到88.88%,幾乎可以將蛋白全部水解,其水解度高于其余3種蛋白酶(圖3)。不同蛋白酶酶解蛋白的作用位點(diǎn)不同,堿性蛋白酶Alcalase 3.0T屬于外源酶,對羧端水性氨基酸的酶解有較強(qiáng)專一性,可水解藜麥麩皮蛋白中的Glu、Met、Leu、Tyr、Lys的羧端肽鍵[20]。藜麥麩皮蛋白中含有較高的谷氨酸(表3),因此堿性蛋白酶酶解徹底,可獲得大量多肽。

圖4 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的肽得率Fig.4 Peptide yield of hydrolyzed products of different proteases

2.4 多肽對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

α-葡萄糖苷酶是糖尿病發(fā)病的主要因素,是胰島素功能精細(xì)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶,是延緩葡萄糖吸收和抑制餐后高血糖的靶點(diǎn)。因此,抑制α-葡萄糖苷酶活性是治療糖尿病的關(guān)鍵。臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列糖和米格列醇,但會(huì)產(chǎn)生一些副作用(如腸胃脹氣、胃痛、腹瀉和肝損傷)[21]。因此,需要尋找更安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

由圖5可知,阿卡波糖隨質(zhì)量濃度增加抑制作用雖不明顯,但效果很好。4種多肽在10 mg/mL和20 mg/mL質(zhì)量濃度下,與陽性對照組比均有極顯著差異。4種多肽均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，隨著質(zhì)量濃度增大抑制作用增強(qiáng)。堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復(fù)合蛋白酶肽和風(fēng)味蛋白酶肽在10 mg/mL時(shí)抑制率分別為17.72%、22.01%、16.22%和40.48%,而在20 mg/mL時(shí)抑制率均有提高，分別為33.30%、32.45%、39.19%和81.67%,其中風(fēng)味蛋白酶水解的多肽抑制效果較其他蛋白酶明顯增強(qiáng)且隨著質(zhì)量濃度的增大抑制率增幅最大。因此可選擇風(fēng)味蛋白酶肽制作α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖5 多肽對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.5 Inhibition rate of polypeptides on α-glucosidase注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)

2.5 多肽對酪氨酸酶的抑制率

酪氨酸酶是黑色素產(chǎn)生的關(guān)鍵酶,控制著黑素的形成過程,其活性程度對色素的沉積起主要作用。黑色素水平的增加會(huì)導(dǎo)致蔬菜、水果和人體皮膚的色素沉著障礙,如黃褐斑、雀斑、老年斑和惡性黑色素瘤。因此,開發(fā)和篩選有效的酪氨酸酶抑制劑在近幾年備受關(guān)注[22]。

本實(shí)驗(yàn)中,測定了4種蛋白酶肽對酪氨酸酶活性的抑制作用。由圖6可知,抗壞血酸對酪氨酸酶抑制作用隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)。堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復(fù)合蛋白酶肽對酪氨酸酶的抑制性也隨濃度增大而增強(qiáng),而風(fēng)味蛋白酶肽隨質(zhì)量濃度增加增幅不明顯,基本維持在30%左右。在20 mg/mL時(shí),除風(fēng)味蛋白酶肽外其他多肽與陽性對照組無顯著性差異,說明堿性蛋白酶肽、中性蛋白酶肽、復(fù)合蛋白酶肽在最高質(zhì)量濃度20 mg/mL與陽性對照組抑制效果接近。

圖6 多肽對酪氨酸酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of polypeptides on tyrosinase注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)

2.6 多肽與Fe2+的螯合率

鐵是人體營養(yǎng)中必不可少的元素,可以通過鹽、金屬螯合劑和鐵螯合肽的形式提供。然而,金屬鹽由于其生物利用度低、吸附性差、穩(wěn)定性差等特點(diǎn),正在被替代。目前,許多研究表明,鐵螯合肽由于在提高生物利用度、吸收和穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢,可望被用作鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑[23]。由圖7可知,堿性蛋白酶肽和中性蛋白酶肽與Fe2+螯合率均隨濃度增加而增強(qiáng),在較高質(zhì)量濃度(10和20 mg/mL)時(shí),抑制率均大于60%。

圖7 多肽與Fe2+的螯合率Fig.7 Chelating rate of peptides with Fe2+

復(fù)合蛋白酶肽和風(fēng)味蛋白酶肽與Fe2+螯合率隨質(zhì)量濃度增加而減弱,復(fù)合蛋白酶肽在10 mg/mL螯合率達(dá)到最大值(66.10%),風(fēng)味蛋白酶肽在各個(gè)質(zhì)量濃度下與Fe2+螯合率均能達(dá)到80%以上,說明風(fēng)味蛋白酶肽具有較好的Fe2+螯合能力,因此可以用風(fēng)味蛋白酶酶解后的多肽制作鐵營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

2.7 多肽對DPPH自由基的清除效果

由圖8可知,經(jīng)4種蛋白酶水解后的多肽對DPPH 自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增大。在10 mg/mL時(shí),中性蛋白酶酶解后的多肽對DPPH清除率達(dá)到85%,與陽性對照相比,中性蛋白酶肽和風(fēng)味蛋白酶肽的清除能力較強(qiáng),其余兩種蛋白酶酶解肽的清除能力較弱。

圖8 多肽對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.8 Effect of polypeptides on scavenging ability of DPPH free radicals注：**與陽性對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)；*與陽性對照組相比具有顯著差異(P<0.05)

3 結(jié)論

本文以藜麥麩皮為原料,先采用體積分?jǐn)?shù)為75%～80%的醇沉淀出大分子蛋白,經(jīng)4種蛋白酶水解后,再用體積分?jǐn)?shù)為75%～80%的醇沉淀法除去多糖和未水解的大分子蛋白,得到多肽,其中堿性蛋白酶對藜麥麩皮蛋白的酶解能力較強(qiáng),多肽得率最高。經(jīng)測定,4種蛋白酶酶解的多肽都具有良好的Fe2+螯合能力,中性蛋白酶酶解的多肽對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力,并隨著多肽質(zhì)量濃度的增加而增加,風(fēng)味蛋白酶肽和堿性蛋白酶肽分別對α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶具有較高的抑制率。本研究結(jié)果揭示了藜麥麩皮蛋白被不同蛋白酶酶解后,多肽所具有的活性程度不同,為后續(xù)研究多肽活性奠定了基礎(chǔ)。