一種檸檬酸蛋白的制備工藝及其衍生產品分析

（武漢華科大生命科技有限公司 湖北 430223）

引言

隨著現代生活水平的不斷提高和科學技術的不斷增強，各類型蛋白質的制備工藝流程不斷簡化，諸多蛋白質種類躍然出現于市場，本文探究了一種檸檬酸蛋白的制備工藝流程及其衍生產品分析，還原了檸檬酸蛋白的實際化學反應過程，對該類蛋白質衍生產品副作用進行剖析，從而為該類蛋白質更好地服務于人類提供一定支撐。

1.背景技術

眾所周知，較為理想的食品微量元素添加劑載體必須克服人體內部腸胃對無機鹽的副作用反應，使患者加強對食品微量元素添加劑的順應性，確保患者更好地吸收營養。蛋白質作為醫學和生物學中的重要微量元素載體，能夠直接克服人體腸胃道對無機鹽的副作用，且能夠使微量元素在人體十二指腸內快速吸收。目前，所擁有的微量元素載體主要包括琥珀酸蛋白、檸檬酸以及氨基乙酸等，大多用于生物醫療領域。但琥珀酸蛋白載體作為微量元素添加劑載體，存在以下不良反應：首先，琥珀酸蛋白絡合微量元素時，實際絡合效率較低，不管是嬰幼兒還是成人，為了補充適量微量元素，都需要一次性服用大量琥珀酸蛋白，服用較為不方便。其次，琥珀酸蛋白質在人體內部的代謝會產生大量的丁二酸，而丁二酸物質對人體的眼睛、皮膚甚至是粘膜等都具有一定的刺激作用。最后，琥珀酸蛋白在實際制備過程中所產生的丁二酸，會使后續流程增加，且丁二酸去除工藝較為復雜，殘留程度較大，因此，迫切需要另一種微量元素絡合效率較高的酰化蛋白，確保該類酰化蛋白制備過程中的副產物和在人體中的正常代謝對人體無影響無刺激，檸檬酸蛋白即為重要試驗，為理想的食品微量元素添加劑載體研究提供了重要參考。

2.檸檬酸蛋白的制備工藝

在檸檬酸蛋白的制備過程中，用作微量元素載體的檸檬酸蛋白必須具備一定的結構特征，而檸檬酸蛋白由蛋白質分子上的伯氨基或伯氨基上的氫被檸檬酸酐所取代，后發生一定酰化反應，最終生成檸檬酸蛋白。其中，所有蛋白質為動物蛋白質、植物蛋白質或其他微生物蛋白質，動物蛋白為酪蛋白、乳蛋白或膠原蛋白中的一種或多種，而最后制備得到的檸檬酸蛋白的酰化度大約為90%-97%左右，所述檸檬酸蛋白具備酸堿兩性，等電點在4.0-5.5之間。另一方面，檸檬酸蛋白的制作可由上述植物蛋白、微生物蛋白、動物蛋白等諸多蛋白質和檸檬酸酐，按照質量比1:0.3-0.6發生一定的酰化化學反應而制得。在此過程中，優選蛋白質和檸檬酸酸酐按照質量比為1:0.4-0.5反應制備為最佳，蛋白為大豆分離蛋白、生物蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白、動物蛋白等。由上述兩類方法所制備的檸檬酸蛋白對微量元素具有很強的絡合容量和較高的絡合效率。例如，采用本研究的檸檬酸蛋白，載鐵量是傳統模式下琥珀酸蛋白載鐵量的1.3-1.5倍左右，且檸檬酸蛋白的制備采用檸檬酸酐酰化蛋白時，實際代謝產物為檸檬酸，而檸檬酸是人體內的內源性物質，對人體無毒無害無影響，制備所得的檸檬酸蛋白具備良好的腸胃順應性，用于微量元素添加載體時能被患者大量吸收。

3.具體實施方式

進一步總結本文所述檸檬酸蛋白的制備工藝流程可知，主要包括以下四個步驟。

(1)蛋白質溶解

首先是溶解蛋白質，可在反應器中加入上述植物蛋白、動物蛋白或其他蛋白質種類，與水攪拌均勻后，采用氫氧化鈉溶液進一步調節pH值，直到蛋白質完全溶解，再實行固液分離，操作后得到蛋白質清液。

(2)酰化

制備人員往溶解蛋白質后所得的蛋白質清液中分別緩慢加入一定量的檸檬酸酐，其中蛋白質和檸檬酸酐的質量比為1:0.3-0.6左右，最佳比例為1:0.4-0.5左右，再使用氫氧化鈉溶液調節溶液pH值，確保蛋白質不被析出。待檸檬酸酐添加完畢后繼續攪拌0.5-2小時左右，緩慢滴加一定量的鹽酸溶液，控制pH值為1.0-5.5左右，最佳pH值范圍為4.0-5.5，進一步攪拌0.5-2小時左右，使加入鹽酸后的溶液沉淀，完全實現固液分離，得到固相檸檬酸蛋白沉淀。在此過程中，蛋白質和檸檬酸發生酰化反應的質量比最佳為1:0.4-0.5，按照該質量比進行試驗，能夠得到酰化度更高、副產物含量更低的合成結果。

(3)純化

將酰化得到的檸檬酸蛋白沉淀和水一同加入反應器中，攪拌均勻后使用氫氧化鈉溶液調節pH值，確保檸檬酸蛋白沉淀完全溶解，實現固液分離后得到液相的檸檬酸蛋白溶液。攪拌的同時向檸檬酸蛋白溶液中加入一定量的鹽酸溶液，控制整體溶液pH值為1:1.0-5.5左右，優選取值范圍為4.0-5.5，能夠使檸檬酸蛋白溶液沉淀完全，實現固液分離，最終得到固相的檸檬酸蛋白粗品。進一步重復純化步驟兩次以上，得到檸檬酸蛋白濕品。

(4)干燥

將檸檬酸蛋白濕品放置于溫度為50－60℃左右的容器中進行干燥，確保檸檬酸蛋白濕品水分降低到5%以下，最終得到檸檬酸蛋白產品，圖1即為整個反應方程式。

圖1 反應方程式

4.衍生產品測定及分析

為進一步分析檸檬酸蛋白的整個制備過程及其衍生產品性能，本文以某實例為研究對象，探討了整個工藝過程。首先，準備合成1千克檸檬酸蛋白所需的千克酪蛋白和0.3千克檸檬酸酐。其中，檸檬酸酐的制備利用帶有攪拌機、氯化鈣干燥管、回流冷凝管和溫度計的四口燒瓶制備。在反應器中加入1千克的酪蛋白和15千克的純化水后充分攪拌融合，進一步加入氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0-9.0，保證酪蛋白完全溶解于純化水中。其次，分別緩慢加入檸檬酸酐0.3千克，使用氫氧化鈉溶液控制溶液整體pH值在6.0-9.0之間。待檸檬酸酐添加完畢后的0.5小時后，緩慢滴入鹽酸溶液控制溶液整體pH值為1.0-4.5之間，再繼續攪拌0.5小時后，利用離心機對其離心，得到檸檬酸酐蛋白沉淀。最后在反應器中加入檸檬酸蛋白沉淀和15千克的純化水，利用氫氧化鈉溶液調節pH值至6.0-9.0，使檸檬酸蛋白沉淀完全溶解，利用離心機離心后得到檸檬酸蛋白沉淀溶液，在充分攪拌后向檸檬酸蛋白質沉淀溶液中加入一定含量的鹽酸溶液，確保溶液整體pH值為4.0-5.5左右，使檸檬酸蛋白沉淀完全。再利用離心機過濾后得到檸檬酸蛋白粗品，重復上述步驟兩三次，最終得到檸檬酸蛋白濕品。將檸檬酸蛋白質濕品放置于不銹鋼托盤上，保證檸檬酸蛋白濕品整體厚度為1cm左右，將其置于真空干燥箱，控制真空干燥箱真空度為-0.06MPa到-0.08MPa，溫度為55℃，再干燥20小時后得到檸檬酸蛋白1.06千克。檢測后發現，檸檬酸蛋白實際酰化度為20.5%。進一步得到檸檬酸蛋白紅外光譜圖如圖2所示，由圖可知，在1666cm-1處檸檬酸蛋白有著較強烈的吸收，而在3285cm-1和2928cm-1處有著中等強度的吸收。

圖2 檸檬酸蛋白紅外光譜圖

進一步探究本文所研究的檸檬酸蛋白制備過程中衍生產品可知，上文所述的檸檬酸蛋白制備過程產生的衍生物主要是檸檬酸蛋白和金屬離子的絡合物，而金屬離子則進一步包含了鐵、鋅、鈣、鍶、銅、鉻等諸多物質，將制備得到的檸檬酸蛋白與鐵、鋅、鈣等金屬離子進行絡合，借助金屬離子總量減游離金屬離子量除以檸檬酸蛋白加入量的方式計算得出最終衍生物中金屬離子的實際絡合度大小，以此判斷整個檸檬酸蛋白制備過程衍生產品的數量多少，為檸檬酸蛋白制備過程優化提供一定數據支撐。

5.結論

通過對檸檬酸蛋白制備工藝流程及各類型優秀制備案例的探究可知，檸檬酸蛋白這一重要生物技術領域發明，能為食品微量元素添加劑載體種類的多樣化提供支持，也能為食品微量元素添加劑載體克服無機鹽腸胃道副反應，保證患者具備良好的食品微量元素添加劑載體順應性，確保食品微量元素被患者更好地吸收提供了更多參考與思路，使各類研究人員能以檸檬酸蛋白制備及其衍生產品為基礎案例，不斷探究其他類型食品微量元素添加劑載體種類，從而為豐富食品微量元素添加劑載體做出應有的貢獻，盡可能地降低當前琥珀酸蛋白、檸檬酸、氨基乙酸等諸多微量元素蛋白載體對人體食品微量元素添加的不良影響，保證微量元素添加劑載體與微量元素的絡合量大幅度增加，整體絡合效率快速提高，為嬰幼兒或其他成人補充適量類型微量元素提供支撐，也在一定程度上簡化了嬰幼兒或成人補充合適劑量微量元素的繁雜流程，盡可能地降低了其他微量元素載體在人體內正常代謝所產生的不良影響，降低了微量元素載體在工業大批量生產中的副作用，為優化微量元素載體實際工藝流程、保證微量元素為人體更好的吸收。