奶牛臨床型乳房炎中血紅素氧合酶/一氧化碳(HO/CO)作用探究

尹福，張全偉，張博皓，白旭，石軍，馬友記，張勇1，，趙興緒1，

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅動物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；4 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

奶牛乳房炎(mastitis)是由微生物感染、理化和機(jī)械等刺激因素造成的奶牛乳腺間質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)局部炎癥性疾病[1-2].按照奶牛臨床表現(xiàn)可將乳房炎分為臨床型和亞臨床型(通常稱為隱性乳房炎)[3].患臨床型乳房炎的奶牛具有典型的“紅熱腫脹”等明顯臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者導(dǎo)致泌乳量減少或無奶[4].目前獸醫(yī)臨床上多采用抗生素療法進(jìn)行乳房炎治療并取得了較好的效果[5].抗生素可增強(qiáng)奶牛免疫力和抑制炎癥反應(yīng)從而達(dá)到治療乳房炎的效果.但自2018年起，我國正式啟動實(shí)施獸用抗菌藥使用減量化和飼料“禁抗”養(yǎng)殖“減抗、限抗”等政策[6].抗生素用于奶牛乳房炎防治明顯受限.因此，篩選和開發(fā)奶牛乳房炎防治的替抗產(chǎn)品已成為當(dāng)前獸醫(yī)臨床研究的重點(diǎn).

血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)系統(tǒng)在動物和人體內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化、氧化應(yīng)激保護(hù)、抑制細(xì)胞凋亡等作用[7-10].血紅素在NADPH及細(xì)胞色素還原酶的作用下被降解產(chǎn)生一氧化碳、膽綠素和鐵蛋白[11-12]，膽綠素經(jīng)膽綠素還原酶作用生成具有抗氧化作用的膽紅素，共同構(gòu)成HO/CO系統(tǒng)[13].HO催化降解血紅素是產(chǎn)生內(nèi)源性CO的主要途徑[14]，而內(nèi)源性CO是機(jī)體內(nèi)一種重要調(diào)節(jié)作用的氣體信號分子.研究表明血紅素氧合酶有誘導(dǎo)型血紅素氧合酶(HMOX1)、結(jié)構(gòu)型血紅素氧合酶(HMOX2)、血紅素氧合酶(HMOX3)三種同工酶.HMOX1又稱為熱休克蛋白32，其發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)、減輕炎癥反應(yīng)等作用[11,15].Yu等[16]研究脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷機(jī)制中發(fā)現(xiàn)HMOX1表達(dá)上調(diào)可發(fā)揮保護(hù)作用.大鼠缺血-再灌注損傷模型中，氯化血紅素誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)可降低肝硬化大鼠的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[17-18].HMOX2主要參與血紅素的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，調(diào)控機(jī)體抗脅迫(如低氧)代謝[19].Han等[20]研究表明HMOX2通過降解血紅素調(diào)節(jié)小鼠肝臟缺氧損傷.HMOX3與HMOX2組成及結(jié)構(gòu)類似，但具體功能和作用機(jī)制尚不清楚.

HO/CO系統(tǒng)相關(guān)研究主要集中在心血管疾病、肺、肝臟、腸損傷等[9-10，21].乳房炎發(fā)生和發(fā)展過程中HO/CO系統(tǒng)是否參與其調(diào)控，目前尚不清楚.為探討HO/CO系統(tǒng)在奶牛臨床型乳房炎發(fā)病過程的調(diào)控機(jī)制，本研究以健康奶牛(對照組)和患臨床型乳房炎奶牛乳腺組織為研究對象，檢測乳腺組織中內(nèi)源性CO、HMOX1和HMOX2基因和蛋白的表達(dá)特點(diǎn)和表達(dá)規(guī)律.探究HO/CO系統(tǒng)在奶牛臨床型乳房炎發(fā)病過程的作用，以期為基于氣體信號分子開發(fā)奶牛乳房炎防治的替抗產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用奶牛以獸醫(yī)臨床癥狀和蘭州乳房炎檢驗(yàn)法(Lanzhou Mastitis Test，LMT)為判斷奶牛乳房健康與否的標(biāo)準(zhǔn).采集泌乳期健康荷斯坦奶牛(正常組，Control，n=3)和患臨床型乳房炎荷斯坦奶牛(試驗(yàn)組，Mastitis，n=3)的乳腺組織，部分組織置于4%多聚甲醛溶液固定，部分組織置于液氮冷凍保存?zhèn)溆?

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)源性一氧化碳(CO)測定 取液氮冷凍保存的乳腺組織100 mg，生理鹽水制備10%組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min取上清，根據(jù)內(nèi)源性一氧化碳(CO)試劑盒(測組織)操作說明(A101-2-1)，采用分光光度計法，檢測各組乳腺組織中碳氧血紅蛋白濃度(HbCO%)、血紅蛋白(Hb)含量、蛋白含量和內(nèi)源性一氧化碳(CO)含量.

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 取100 mg乳腺組織，經(jīng)液氮迅速研磨后，按照TransZol UP RNA提取試劑盒(北京全式金生物公司)操作說明[22]，提取各組乳腺組織總RNA，超微量核酸測定儀測定其總RNA濃度和純度，根據(jù)測定結(jié)果，統(tǒng)一調(diào)至700 ng/mL，按Evo-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II(AG艾克瑞生物)操作說明合成cDNA，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中牛GAPDH基因(NM_001034034.2)，HMOX1基因(NM_001014912.1)及HMOX2基因(NM_001035087.2)CDS序列，使用Primer Premier 3.0設(shè)計各基因的特異性引物，引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成(表1).

表1 引物序列信息

1.2.4 熒光定量PCR 以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL：包括2×SYBR Green ProTaqHS Premix *6 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，RNase free water 8 μL.PCR反應(yīng)程序采用兩步法：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；58 ℃ 30 s；共40個循環(huán).每個樣本重復(fù)3次，待反應(yīng)結(jié)束，觀察擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采集Ct值.采用2-ΔΔCt法[23]分析基因的表達(dá)量.

1.2.5 免疫印跡 稱取各組乳腺組織100 mg，經(jīng)液氮充分研磨后，加入1 mL含1%苯甲基黃酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)和蛋白酶抑制劑(protease inhibitor mixture，PIC)的高效細(xì)胞組織裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA)，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min、離心取上清液.BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)測定各個樣本蛋白濃度，取適量蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃變性10 min后，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹24].每孔總蛋白上樣30 μg，經(jīng)5% SDS-PAGE濃縮膠和12%分離膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)，封閉后，加兔源β-actin一抗(1∶4 000)、HMOX1一抗(1∶500)和HMOX2一抗(1∶600)(抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔 IgG (1∶5 000)、 (1∶8 000)，37 ℃ 50 r/min孵育1 h，加底物化學(xué)發(fā)光液(electronchemi-luminescence，ECL)發(fā)光顯色 、化學(xué)發(fā)光儀曝光.Image J軟件掃描HMOX1、HMOX2 和內(nèi)參β-actin蛋白灰度值，每個條帶重復(fù)3 次后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.2.6 蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學(xué)染色 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H&E)：將固定好的乳腺組織包埋，制備石蠟切片厚度為4～5 μm，經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、伊紅復(fù)染、樹膠封片后，鏡下攝片并分析數(shù)據(jù).免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC)：組織切片60 ℃烘3 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，抗原修復(fù).按照免疫組化試劑盒說明書[25]，依次加3% H2O2，室溫10 min，封閉液(A 液)室溫30 min、兔源HMOX1一抗(1∶200)、兔源HMOX2一抗(1∶240)，陰性對照加磷酸鹽緩沖液，4 ℃過夜孵育、試劑B 和試劑C孵育30 min、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、流水沖洗返藍(lán)、梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，使用Olympus Dp71生物顯微鏡攝像[26].

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織中內(nèi)源性一氧化碳(CO)的含量

兩組乳腺組織中碳氧血紅蛋白濃度、血紅蛋白含量、蛋白含量以及內(nèi)源性CO含量均有差異(圖1)，與正常組相比較，臨床型乳房炎乳腺組織中碳氧血紅蛋白濃度降低(圖1-A)；血紅蛋白含量降低(圖1-B)；蛋白含量升高(圖1-C)；內(nèi)源性CO含量上調(diào)，顯著高于正常組(P<0.01)(圖1-D).

A：碳氧血紅蛋白濃度(HbCO%)；B：血紅蛋白(Hb)含量；C：蛋白含量(g·L-1)；D：內(nèi)源性CO含量(μmol·g-1).A：Carboxyhemoglobin concentration (HbCO%)；B：Hemoglobin (HB) content;C：Protein content (g/L);D：Endogenous CO content (μmol/g).圖1 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織中的內(nèi)源性一氧化碳(CO)含量Figure 1 Content of endogenous carbon monoxide (CO) in mammary gland tissue of dairy cows with clinical mastitis

2.2 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織病理形態(tài)觀察

經(jīng)H&E染色后觀察兩組乳腺組織的病理變化(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組乳腺組織無病理變化，各結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列有序，腺泡充盈，內(nèi)有大量乳汁，處于泌乳期(圖2-A)；患臨床型乳房炎奶牛乳腺組織呈現(xiàn)典型的病理形態(tài)如乳腺結(jié)構(gòu)模糊，腺泡腔塌陷、變形，部分上皮細(xì)胞脫落，腔內(nèi)含有大量白細(xì)胞，其中又以噬中性粒細(xì)胞居多(圖2-B).

A：正常組；B：臨床型乳房炎組；CT：結(jié)締組織；MA：乳腺腺泡；BV：血管；MEC：乳腺上皮細(xì)胞；PN：噬中性粒細(xì)胞.A：Control group；B：Clinical mastitis group；CT：connective tissue；MA：mammary gland acinus；BV:blood vessel;MEC：mammary epithelial cells；PN：phagocytic neutrophils.圖2 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織病理形態(tài)觀察(H&E染色)Figure 2 Histopathological observation of mammary gland in dairy cows with clinical mastitis (H&E staining)

2.3 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織中HMOX1和HMOX2蛋白表達(dá)定位

兩組乳腺組織中均可見HMOX1和HMOX2蛋白(棕黃色顆粒)的表達(dá)(圖3).正常組乳腺組織結(jié)構(gòu)完整(圖Control)，臨床型乳房炎組可見明顯乳腺組織病變(圖Mastitis).

HMOX1和HMOX2蛋白在乳腺組織均有表達(dá)，主要在乳腺上皮有陽性表達(dá)，臨床型乳房炎組和正常組相比，HMOX1蛋白相對表達(dá)量增加(圖3-A3)，HMOX2蛋白相對表達(dá)量下降(圖3-B3).

A：HMOX1蛋白表達(dá)分布；B：HMOX2蛋白表達(dá)分布；C：陰性對照組；1為正常組；2為臨床型乳房炎組；箭頭表示陽性表達(dá)，MEC:乳腺上皮細(xì)胞.A：HMOX1 protein expression and distribution；B：Hmox2 protein expression distribution；C：Negative control group；1 as normal group;2 for clinical mastitis group；The arrow indicates positive expression，MEC：mammary epithelial cells.圖3 奶牛臨床型乳房炎乳腺中HMOX1和HMOX2蛋白定位表達(dá)Figure 3 Expression of HMOX1 and HMOX2 in mammary glands of dairy cows with clinical mastitis

2.4 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織中HMOX1和HMOX2 mRNA表達(dá)規(guī)律

兩組乳腺組織中均有HMOX1和HMOX2mRNA表達(dá)(圖4).與正常組中目的基因HMOX1和HMOX2表達(dá)量相比較，試驗(yàn)組中HMOX1顯著上調(diào)，差異極顯著(圖4-A)(P<0.01)；相反，試驗(yàn)組中HMOX2表達(dá)量顯著下調(diào)，差異極顯著(圖4-B)(P<0.01)，且HMOX1的差異表達(dá)倍數(shù)遠(yuǎn)高于HMOX2.

2.5 臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中HMOX1和HMOX2蛋白的表達(dá)規(guī)律

兩組乳腺組織中均有HMOX1和HMOX2蛋白表達(dá)(圖5).與正常組相比較，試驗(yàn)組中HMOX1表達(dá)量明顯上調(diào)(圖5-A和5-B)，而HMOX2表達(dá)量明顯下調(diào)(圖5-A和5-C)，均存在顯著性差異(P<0.05).HMOX1和HMOX2在組內(nèi)也存在一定的差異.

3 討論

血紅素氧合酶(HMOX)催化血紅素降解生成CO、膽紅素和鐵蛋白，內(nèi)源性CO作為內(nèi)源性氣體信號分子參與和調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)生理功能，在不同細(xì)胞起到抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激和擴(kuò)張血管等作用[8].目前研究發(fā)現(xiàn)，HO/CO系統(tǒng)與臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，并且在不同病變組織中差異表達(dá).Ibrahim等[27]通過氯化血紅素誘導(dǎo)血紅素加氧酶(HMOX)活性改變內(nèi)源性一氧化碳(CO)生成，發(fā)現(xiàn)可以明顯減輕大鼠胃粘膜損傷；胡修忠等[28]通過建立H2O2誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞損傷模型后，發(fā)現(xiàn)HMOX1表達(dá)量升高，對牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞存在調(diào)控作用，降低氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷；王云濤等[29]在切口痛大鼠模型中發(fā)現(xiàn)HMOX1蛋白表達(dá)增加，可降低炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)的破壞，發(fā)揮細(xì)胞的保護(hù)作用.本研究首先通過測定內(nèi)源性CO含量發(fā)現(xiàn)臨床型乳房炎乳腺組織中內(nèi)源性CO明顯高于正常組，再通過qRT-PCR、Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)HMOX1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這可能是由于乳腺組織在病變過程中巨噬細(xì)胞參與免疫，釋放出多種細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生誘導(dǎo)HMOX1表達(dá)的產(chǎn)物，如炎癥因子、內(nèi)毒素等，誘導(dǎo)HMOX1表達(dá)，催化反應(yīng)生成CO，說明HO/CO對乳房炎發(fā)病過程中具有重要作用.近年來研究發(fā)現(xiàn)HMOX2是血紅素氧感受器[19]，HMOX2通過自身降解來響應(yīng)細(xì)胞血紅素缺乏，幫助恢復(fù)血紅素的動態(tài)平衡[30].本研究發(fā)現(xiàn)HMOX2 mRNA和蛋白在患臨床型乳房炎乳腺組織中表達(dá)量較正常組顯著下降，HMOX2可能通過自身表達(dá)調(diào)控，在HO/CO中發(fā)揮作用.HMOX1廣泛分布于脾臟、肝臟和骨髓等代謝活躍的器官；HMOX2主要分布于腦內(nèi)，在血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)[13].本研究通過免疫組織化學(xué)染色觀察到HMOX1蛋白和HMOX2蛋白在乳腺組織均表達(dá)，與mRNA呈正相關(guān)，且陽性表達(dá)主要分布在乳腺上皮細(xì)胞，保護(hù)損傷的細(xì)胞，更進(jìn)一步說明HO/CO對維持乳腺組織生理起重要的作用.HMOX1和HMOX2兩種同工酶活性一增一減，調(diào)節(jié)內(nèi)源性CO含量，共同調(diào)節(jié)乳腺組織生理功能，發(fā)揮其保護(hù)作用.綜上所述，內(nèi)源性CO、HMOX1、HMOX2與其蛋白在對照組和患臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中均表達(dá)且表達(dá)趨勢存在差異，HO/CO系統(tǒng)參與細(xì)菌性奶牛臨床型乳房炎的發(fā)生與發(fā)展，其可能調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的功能，發(fā)揮抗炎和細(xì)胞損傷保護(hù)等作用.這將為奶牛臨床型乳房炎及相關(guān)疾病中HO/CO系統(tǒng)功能的研究提供理論參考，也為開發(fā)奶牛乳房炎防治的替抗產(chǎn)品提供參考依據(jù).

A：HMOX1 的相對mRNA 水平；B：HMOX1的相對mRNA水平(內(nèi)參基因：GAPDH;n=3).**表示差異極顯著(P<0.01).A：The relative mRNA level of HMOX1;B：The relative mRNA level of HMOX1 (internal reference gene：GAPDH;n=3).** The difference was very significant(P<0.01).圖4 奶牛乳腺組織中HMOX1和HMOX2 mRNA表達(dá)規(guī)律Figure 4 Expression of HMOX1 and HMOX2 mRNA in mammary gland of dairy cows

A：乳腺組織中HMOX1和HMOX2蛋白Western blot結(jié)果；B：HMOX1蛋白的相對表達(dá)量；C：蛋白的相對表達(dá)量 (內(nèi)參:β-actin 蛋白；n=3).相同字母表示無差異，不同字母表示差異顯著(P<0.05).A：HMOX1 and HMOX2 protein in breast tissue were detected by Western blot；B：The relative expression of HMOX1 protein；C：The relative expression of protein (internal reference gene:β-actin protein;n=3).There was no difference in the same letters，but significant difference in different letters(P<0.05).圖5 奶牛臨床型乳房炎乳腺組織中HMOX1和HMOX2蛋白的表達(dá)規(guī)律Figure 5 Expression of HMOX1 and HOMX2 protein in breast tissue of dairy cows with clinical mastitis