黑果枸杞微衛星DNA與花青素、多酚和黃酮的關聯分析

陳小瑛，孔東升,,3，王立，陳艷霞，柯善文

(1.甘肅農業大學林學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省黑果枸杞工程研究中心，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)的多年生耐鹽、抗旱灌木.主要分布于我國新疆、內蒙、青海、寧夏及陜西東部等地[1]，是干旱荒漠區重要的水土保持樹種.其果實也是迄今為止發現含原花青素最高的野生植物[2]，且藥食兼用，具有強腎、潤肺、明目、健胃、補腦、抗衰老及通經作用[3].關于黑果枸杞果實的研究大多集中在有效成分的藥理作用[4-6]、化學成分[7-8]、以及微量元素[9-10]等方面.

SSR(simple sequence repeats，SSR)標記是近年發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱微衛星DNA，是一類由幾個堿基組成的串聯重復序列.每個SSR兩側的序列一般是相對保守的單拷貝序列，串聯重復而成的DNA序列數量豐富、覆蓋整個基因組、揭示的多態性高[11].它以孟德爾方式遺傳，呈共顯性[12-14].微衛星DNA以遺傳基因組學為基礎，是植物有效成分生物合成途徑中的分子機制.植物中次生代謝產物的合成和積累受遺傳基因控制，由其自身生物遺傳特性決定[15].李瑞明[16]、張蕊[17]、楚秀麗[18]，分別通過研究不同種源的毛脈酸模根、2年生南方紅豆杉、青錢柳葉片黃酮類物質，揭示了不同地理種源(基因型)對次生代謝產物積累的不同影響及作用.徐茂軍[19]研究了細胞內部的信號轉導系統對植物次生代謝產物合成的影響，表明植物體內次生代謝物質的合成受細胞內部相關基因調控.

目前，黑果枸杞在分子水平上的研究已取得一定的進展.林麗[20]、阿力·同其米克[21]用ISSR分子標記對黑果枸杞進行遺傳多樣性研究，分析了不同居群間的相關遺傳參數，表明所研究的黑果枸杞有高的遺傳多樣性且遺傳背景復雜.尹躍[22]、黃興發[23]則對黑果枸杞分子標記進行開發，為黑果枸杞構建遺傳圖譜以及遺傳多樣性的研究提供了可行的標記選擇.許興[24]等利用RAPD分子標記技術,對不同地區主要栽培的寧夏枸杞品進行了分析，構建了主要推廣品種寧杞1號的RAPD圖譜.但是以SSR分子標記分析微衛星標記與黑果枸杞數量性狀關聯研究未見報道，這使得黑果枸杞在分子標記輔助育種以及遺傳多樣性方面的研究進程緩慢，導致人們無法充分合理的開發和利用該資源.

本試驗采用SSR分子標記的方法，選擇已經發表的枸杞分子標記開發的相關報道中的23個微衛星標記[25-26]，與黑果枸杞果實中花青素、多酚和黃酮的相關性進行研究.以期為黑果枸杞分子標記輔助育種、遺傳圖譜的構建和優良品種選育提供參考，并為黑果枸杞分子育種和產業發展奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年9月對甘肅省玉門的黑果枸杞進行種質資源調查、收集與研究.該地區屬于大陸性溫帶干旱氣候，晝夜溫差大，平均海拔1 200 m，年平均氣溫7.5 ℃，年平均降水量63.3 mm，蒸發量2 952 mm.通過樹勢、樹高、冠幅、干高、胸徑、葉片形狀、果實特征等表型數據初選黑果枸杞優樹100株，采摘其果實，進行相關處理并在實驗室進行花青素、多酚和黃酮含量的測定.以花青素含量為主要經濟性狀，按照K-均值聚類法以相似性原則將其分為高、中、低3類，在3類中分別選取14株作為SSR分子標記試驗材料.

1.2 主要試驗試劑

香草醛、矢車菊-3-O-葡萄糖苷、沒食子酸標準品、蘆丁標準品、福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、鹽酸、硫酸均為分析純、甲醇為色譜純、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit、Agarose D-1 LE、DL10,000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、6×DNA Loading Buffer、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)購于寶日醫生物技術有限公司，12% Precast-GLgel Tris-Glycine電泳預制膠購于上海生工生物工程股份有限公司.

1.3 試驗儀器

恒溫水浴鍋(型號 DK-98-Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司)、索氏提取器、紫外可見分光光度計(型號UV-1701PC)、高通量組織研磨器、小型離心機、BIO-RAD梯度基因擴增儀(T100，時代聯想生物技術有限公司)、垂直電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)、水平電泳儀(DYCP-32A,北京六一儀器廠)、UVP凝膠成像系統(GelDoc-It 2315).

1.4 試驗方法

1.4.1 花青素含量的測定 花青素含量的測定參照賀盼[27]試驗方法進行.繪制標準曲線，然后取上清液，在分光光度計545 nm處測其吸光度，試驗重復3次.采用硫酸-香草醛法測定含量.其計算公式計算為：

含量(%)=(Ax×Cr/Ar)×D/W×100%

式中：Ar為對照品溶液吸光度，Ax為供試品溶液吸光度，Cr為對照品溶液濃度，D為稀釋倍數，W為試驗材料質量.

1.4.2 多酚含量的測定 多酚含量的測定參照祁

銀燕[28]試驗方法進行.建立標準曲線，取上清液，在分光光度計765 nm處測吸光值,試驗重復3次.計算公式如下：

含量(mg/g) =(X1×V1×V2)/W

式中：X1為根據標準曲線計算得樣品濃度值(mg/mL),V1為提取液稀釋倍數,V2為提取液總體積(mL),W為原料干質量(g).

1.4.3 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定參照李淑珍[29]方法進行.建立標準曲線，取上清液，在分光光度計510 nm測其吸光度，實驗重復三次.計算公式如下：

式中：y是樣液濃度(mg/mL)，v1是樣液體積(mL)，v2是樣品定容體積(mL)，v3是顯色反應測定時取用樣液體積(mL)，m是樣品量(g).

1.4.4 引物的種類與合成 試驗所引用的23個微衛星標記來源于已經發表的枸杞分子標記開發的相關報道，引物名稱和退火溫度詳見表1.其由上海生工生物工程股份有限公司合成.

表1 23個引物相關資料

1.4.5 DNA的提取與檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，配置1%瓊脂糖凝膠將提取的DNA進行電泳，-20℃保存.

1.4.6 PCR反應體系與擴增程序 PCR反應體系：總體積為10 μL，其中模板DNA為0.5 μL，上下游引物共0.5 μL，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye) 5 μL，dH2O 4 μL.

PCR擴增程序：98 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，72 ℃后延伸5 min，PCR產物-20 ℃保存.

1.4.7 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 用12%的聚丙烯酰胺凝膠對PCR產物進行檢測，并以DL2000 DNA Marker作為參照.電泳電壓為150 V，時間為1 h，等標準參照染料跑至膠板底部時，切斷電源，停止電泳.取出凝膠后采用硝酸銀染色后進行凝膠成像.

1.5 統計分析

參照DL2000 DNA Marker，并利用Gene Mapper 4.0軟件判定所有樣品的基因型.用Microsoft Excel對初始數據進行整理.用popgene 32.0計算微衛星有效等位基因數(Ne)、期望雜合度(E_Het)等群體參數，按照以下公式計算多態信息含量(PIC)[30]，其中m為等位基因數量，Pi為第i個等位基因的頻率.

用SPSS 25.0進行正態分布檢驗與方差分析.用單因素ANOVA法對微衛星位點不同基因型與經濟性狀進行相關性分析，若微衛星位點與性狀間具有顯著性差異，則用LSD進行多重比較.

2 結果與分析

2.1 性狀分布

對黑果枸杞青花素、多酚和黃酮含量進行正態分布檢驗(表2)，三者P值均大于0.05，說明其含量頻率分布均符合正態分布.

表2 花青素、多酚和黃酮的正態性檢驗

2.2 電泳結果

2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳 對提取的42株黑果枸杞果實的DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如圖1所示，展示了部分樣品DNA提取結果.

2.2.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 用23對微衛星引物對42個樣本基因組DNA進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，各微衛星均獲得了穩定、清晰的DNA條帶,并在個體間表現出不同程度的多態性.圖2顯示位點KY284848對部分黑果枸杞個體擴增結果.

2.3 遺傳多樣性分析

23個微衛星位點遺傳多樣性信息見表3.共檢測到89個等位基因，平均為3.87個，其中位點KY284849、KY284856、KY28485均為5個.Ne最多的是KY284856(3.84)，最少的是c23113-g1(1.96)，平均為2.98.觀測雜合度在0.43～0.90之間，多態信息含量在0.41～0.69之間.

M表示Marker DL10000；1～10分別表示10個樣本個體.M means Marker DL10000；1～10 means 10 sample individuals respectively.圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAFigure 1 Detection of DNA by 1% agarose gel electrophoresis

M表示Marker DL2000，1～14為14個樣本個體.M means Marker DL2000；1～14 are 14 sample individuals.圖2 位點KY284848 在黑果枸杞的PCR產物檢測結果Figure 2 The detection result of PCR product of site KY284848 in Lycium ruthenicum

表3 黑果枸杞23個微衛星位點多態信息

2.4 微衛星標記與花青素、多酚、黃酮的關聯分析

運用SPSS軟件對各位點不同基因型與所對應的花青素、多酚和黃酮含量的差異情況進行方差分析，結果發現5個微衛星標記與黑果枸杞的經濟性狀有關聯.

由表4可知，位點c88061_g1_i1在含量高的水平上，不同基因型之間花青素含量呈顯著差異(P<0.05).在4種基因型中，CD顯著高于AC(P<0.05)，AB和CC無顯著差異(P>0.05)，在含量中的水平上，AC黃酮含量顯著高于AB(P<0.05).

由表5可知，位點c60533_g1_i1在含量低的水平上，不同基因型之間多酚含量呈顯著差異(P<0.05).在3種基因型中，AA顯著高于AB和BC(P<0.05)，AB和BC無顯著差異(P>0.05).

由表6可知，位點c58466_g1_i1在含量中的水平上，不同基因型之間花青素呈顯著差異(P<0.05)，AC顯著高于AD(P<0.05),AB與AC和AD無顯著差異(P>0.05).

表4 位點c88061_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表5 位點c60533_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表6 位點c58466_g1_i1不同基因型間黑果枸杞性狀差異

由表7可知，位點KY284852在含量低的水平上，不同基因型之間花青素和多酚含量之間呈顯著差異(P<0.05)，BD花青素、多酚含量顯著高于AD(P<0.05)，BD、CD和BC無顯著差異(P>0.05).

由表8可知，位點KY284857在含量中的水平上，不同基因型之間多酚含量呈顯著差異(P<0.05).BD顯著高BC(P<0.05)， BD和BB之間無顯著差異(P>0.05).

表7 位點KY284852不同基因型間黑果枸杞性狀差異

表8 位點KY284857不同基因型間黑果枸杞性狀差異

3 討論

3.1 黑果枸杞遺傳多樣性分析

生物群體遺傳變異是生物進化的原始材料，遺傳多樣性則是物種生存、發展和進化的基礎.按照Botstein[31]對于遺傳多樣性的判別標準，選用的23個微衛星座位中，18個位點的PIC>0.5為高度多態性座位，5個位點0.25

3.2 微衛星標記與花青素、多酚和黃酮的關聯分析

QTL連鎖分析是對不同基因型個體的數量性狀表型應用統計學的方法，進行顯著性檢驗,如果差異顯著說明微衛星標記與數量性狀存在關聯[37].利用SSR分子標記方法進行的關聯分析不需要建立遺傳圖譜，可以直接對位點基因型與所對應的性狀之間的差異進行關聯分析.SSR與經濟性狀的關聯分析在水稻[38]、大麥[39]、大豆[40]、油菜[41]等作物中應用較多，可見關聯分析在發掘位點、尋找優良變異類型方面有明顯的優勢.

但關聯分析在黑果枸杞中的研究鮮見，究其原因有：對枸杞群體結構、表型及基因型鑒定的分析不足，影響了人們對相關基因的標記開發；表型差異與環境的相互作用，使得人們對QTL功能的認知不足.趙建華等[42]對枸杞部分農藝性狀形成的分子機制進行了研究，克隆到LbA1基因,在分析中發現LbA1基因表達量與枸杞果實果糖含量達到極顯著相關.朱雪冰等[43]克隆了黑果枸杞中調節花青素合成代謝的MYB基因.本試驗用SSR分子標記方法對花青素、多酚和黃酮與位點基因型進行關聯分析.結果發現：位點c88061_g1_i1與花青素和黃酮相關；c60533_g1_i1、KY284857與多酚相關；c58466_g1_i1與花青素相關；位點KY284852與花青素和多酚相關，存在一因多效和多因一效現象，說明這些標記位點可能是控制花青素、多酚、黃酮的主效基因,或與控制數量性狀的主效基因連鎖.在生產實踐中，選擇具有和優良性狀相關的標記進行個體選育，可最大限度發揮黑果枸杞的某些經濟性能，提高其經濟價值.試驗中檢測到與數量性狀相關的位點較少，可能是因為所用材料遺傳豐富度不夠、選用的微衛星標記數量有限.

通過數量性狀與分子標記相關性分析，可找到與黑果枸杞經濟性狀相關聯的標記，從而選擇和定位數量性狀基因，以此用于分子標記輔助選擇育種，可以提高黑果枸杞優選效率.上述所說的微衛星標記與黑果枸杞花青素、多酚、黃酮的關聯分析只是初步研究，還需要擴大樣本量進行進一步的研究，但本試驗研究結果從分子水平上為黑果枸杞的早期選育、高效育種和遺傳改良提供了理論依據.

4 結論

1) 試驗所選用的23個微衛星位點中，平均多態信息含量(PIC)為0.59，平均觀測等位基因數為3.87，期望雜合度在0.49～0.75之間，說明該群體遺傳多樣性處于較高水平，并且有較強的遺傳潛力.

2) 關聯分析發現23個位點中，有5個與黑果枸杞中花青素、多酚和黃酮有關聯，所篩選出的微衛星位點，可以為黑果枸杞早期的良種選育提供依據.