羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA的提取方法比較

翁秀秀，劉婷

(1.蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

幼齡反芻動物瘤胃發育與其健康和營養關系密切[1].瘤胃組織形態學發育[2-3]，瘤胃發酵功能完善[4-5]和瘤胃微生物的定植[6]是衡量瘤胃發育的重要指標.其中，探討瘤胃微生物區系的定植規律是當前幼齡反芻動物瘤胃發育的研究熱點.16S rRNA測序技術已經成為一種普遍方法用于瘤胃微生物區系多樣性的研究.前期研究發現，幼齡反芻動物剛出生時，瘤胃內是一個無菌的環境，出生后24 h，來自于初乳和環境的微生物在瘤胃內快速定植.變形菌被擬桿菌逐漸代替；第3天到第12天之間，瘤胃尚未發育成熟，但許多細菌組成的細菌群落已經能被檢出，第9天到第15天之間，瘤胃微生物迅速定植，門水平變化的研究結果存在差異；從15 d開始，盡管一些微生物在屬的相對豐度發生變化，但在門水平不再表現出明顯的時間相關性[7-9].這些研究結果的差異大多歸結于飼料組成和飼養方式的差異，卻忽略了這些研究中瘤胃微生物基因組DNA提取方法不同引起結果出現差異的可能性.Yu等[10]提出瘤胃微生物群落結構的研究也受DNA提取方法的影響，也有學者研究證實了這一觀點[11-12].目前提取瘤胃微生物基因組DNA的方法眾多，其中對比成年反芻動物瘤胃微生物基因組DNA的方法也有相關報道[13-15]，如隋昶生等[13]的結果表明，凍融法結合CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)更適合提取嶗山奶山羊瘤胃微生物總DNA；張玲等[14]采用酶解、凍融和SDS(十二烷基磺酸鈉)、CTAB相結合的方法提取雙峰駝瘤胃微生物總DNA，得到的瘤胃微生物DNA濃度和穩定性更高；Durgadevi等[15]對山羊瘤胃微生物基因組DNA的提取方法做了系統的優化.但適合于羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA提取方法的研究卻鮮有報道.綜上所述，本試驗擬改進傳統瘤胃內容物微生物基因組DNA的提取方法，利用q-PCR技術進行瘤胃細菌和古菌拷貝數分析，比較不同提取方法對羔羊瘤胃內容物中微生物多樣性的影響，以期篩選出適用于羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA的提取方法.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗選用6只健康、體質量接近(9.53±0.87 kg)、飼喂同種飼料的56日齡湖羊公羔.羔羊頸靜脈放血屠宰后，迅速分割出瘤胃，混勻瘤胃內容物后，用5 mL凍存管(滅菌)收集瘤胃內容物，快速放入液氮罐中帶回實驗室，-80 ℃超低溫冰箱中保存，作為瘤胃微生物基因組DNA提取的試驗樣品.

1.2 主要試劑與儀器設備

CTAB、NaCl、EDTA(乙二胺四乙酸)、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、GITC(異硫氰酸胍)、SDS均為國產分析純；Tris-HCl(pH 8.0)、蛋白酶K、PBS(磷酸鹽緩沖液，pH 7.2 )購自北京Solarbio生物公司；M5 HiPer pTOPO-TA Cloning Kit(快速克隆試劑盒)購自北京聚合美生物科技有限公司；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit(質粒DNA提取試劑盒)購自美國Axygen公司；qPCR SuperMix購自浙江博而金科技股份有限公司.

ND-1000微量紫外分光光度計購自美國 Nanodrop公司；q-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；MS 3 basic漩渦振蕩器購自艾卡(廣州)儀器設備有限公司.

1.3 微生物基因組DNA提取

液氮研磨+珠磨+CTAB法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，稱取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，再加入1.0 mL提取液[1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、2% CTAB和0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)]，用漩渦振蕩器混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70 ℃水浴15 min，90 ℃水浴5 min，室溫下14 000 r/min離心10 min，轉移上清液至1.5 mL離心管中，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)，劇烈搖勻，室溫14 000 r/min離心10 min，可見有3層，將上清移至1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻；隨后轉入-20 ℃冰箱過夜；過夜解凍后室溫14 000 r/min離心10 min，棄上清可見有白色DNA沉淀，加入70%酒精沖洗沉淀2次，每次離心10 min，倒置風干至半干，用50 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，-20 ℃保存.

珠磨+CTAB法：將6份冷凍樣品解凍后混合均勻，并稱取0.5 g混合樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，以下步驟同液氮研磨+珠磨+CTAB法.

液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中并加入0.3 g玻璃珠，再加入1 mL提取液(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.5% NaCl、4% SDS和0.1 mol/L EDTA)，渦旋混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70℃孵育15 min，90℃孵育5 min；加入200 μL 5 mol/L GITC，混勻后繼續 65 ℃水浴15 min，1 4000 r/min離心10 min，轉移上清至1.5 mL離心管中，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)500 μL，搖勻后靜置5 min，14 000 r/min離心10 min，抽取上清至1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積預冷的異丙醇，冰上放置1 h；14 000 r/min離心10 min，移除試管內液體，保留白色沉淀，加入70%酒精沖洗沉淀2次，每次離心10 min，倒置風干至半干，用50 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，-20℃保存.

液氮研磨+CTAB+SDS法：將6份冷凍樣品混合于研缽(滅菌)中，加液氮充分研磨并混勻，稱取0.5 g研磨后的樣品于2 mL離心管中，加入1 mL提取液 [100 mmol/LTris- HCl(pH 8.0)、1.5% NaCl、1% CTAB、0.1 mol/L EDTA和10 mmol/L PBS(pH 7.2)]和75 μL 10% SDS，渦旋混勻5 min；加入20 μL蛋白酶K，70 ℃孵育15 min，90 ℃孵育5 min，室溫14 000 r/min離心10 min，轉移上清至1.5 mL離心管中，加入苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)500 μL，搖勻后靜置5 min；以下步驟同液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法.

將提取的微生物基因組DNA樣品置于-20 ℃冰箱中妥善保存，便于后續試驗分析.

1.4 基因組DNA濃度、純度及片段完整性檢測

提取到的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段完整性，用微量紫外分光光度計測定微生物基因組DNA濃度(ng/μL)及D260/280和D260/230比值.

1.5 q-PCR分析

1.5.1 q-PCR標準曲線制作 用M5 HiPer pTOPO-TA Cloning Kit快速克隆試劑盒對目的基因進行克隆，具體操作嚴格參考說明書.用AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit提取微生物質粒DNA.檢測質粒DNA濃度，根據各質粒的分子量與質量濃度計算獲得拷貝數，并進行10倍的連續梯度稀釋，取8個稀釋梯度制得標準品作為模板進行q-PCR反應，每梯度3個重復，繪制Ct值與質粒拷貝數間關系的定量標準曲線.各菌所用引物序列見表1.

標準質?？截悢涤嬎愎?

質?？截悢?copies/μL)=濃度(ng/μL)×10-9(ng/μL與g/μL之間的換算)×6.02×1023(copies/mol) / [660(g/mol/bp) ×質粒堿基對數(bp)][16].

1.5.2 q-PCR檢測條件 標準質粒和樣品的q-PCR反應體系均采用20 μL體系.反應體系：2×Biogold qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，質粒DNA模板(樣品DNA模板)1 μL，雙蒸水8.2 μL.反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環，72 ℃延伸10 min.

1.5.3 樣品中微生物的拷貝數計算 將每種微生物的Ct值代入相應的標準曲線，利用公式計算得到樣品中的微生物拷貝數，對結果進行log轉換后再進行數據分析.

計算公式：拷貝數(copies/g)=(MQ×C×VD)/(S×V).其中MQ為根據標準曲線Ct值得到的拷貝數(copies)，C是每個樣品基因組DNA 的濃度(ng/μL)，VD是提取DNA時最后溶解DNA 的雙蒸水的體積(μL)，S為用于q-PCR的DNA量(ng)，V為提取DNA時所稱量的樣品量(g)[23].

表1 微生物引物序列

1.6 數據統計分析

用SPSS 19.0統計分析軟件對測得的DNA濃度、D260/280、D260/230比值和不同微生物log(拷貝數)進行單因子方差(one-way ANOVA)分析，差異顯著時，采用Duncan’s法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性評判標準.

2 結果與分析

2.1 不同方法提取瘤胃內容物微生物基因組DNA的濃度、純度及片段完整性比較

從圖1可以看出，4種提取方法均能得到微生物基因組DNA，但提取效果存在差異.液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法條帶較暗且條帶下部有明顯拖尾現象，液氮研磨+CTAB+SDS法條帶較液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法弱，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法條帶最亮，條帶無拖尾也無雜質污染，說明該方法所獲得的基因組DNA產量較高.

由表2可以看出，4種方法所提取的瘤胃內容物微生物基因組DNA濃度和D260/280、D260/230比值均存在顯著差異(P<0.001).珠磨+CTAB法獲得的DNA樣品濃度最高，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法獲得的DNA濃度次之，平均濃度為1 121.15 ng/μL.OD260/280比值反映蛋白質污染情況，測得液氮研磨+珠磨+CTAB法、珠磨+CTAB法和液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所得DNAD260/280>1.9，液氮研磨+CTAB+SDS法所得DNA樣品D260/280<1.8.D260/230比值表征DNA樣品中碳水化合物、腐殖酸和酚類等污染情況，4種方法所得DNAD260/230比值均小于2.0，其中液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法該值最高為1.92，顯著大于另外3種方法(P<0.001)，液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法，液氮研磨+CTAB+SDS法D260/230比值最低.

液氮研磨+珠磨+CTAB法(Ⅰ)；珠磨+CTAB法(Ⅱ)；液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法(Ⅲ)；液氮研磨+CTAB+SDS法(Ⅳ).Liquid nitrogen grinding+bead mill+CTAB method (Ⅰ);Bead mill+CTAB method (Ⅱ);Liquid nitrogen grinding+bead mill+SDS+GITC method (Ⅲ);Liquid nitrogen grinding+CTAB.SDS method (Ⅳ).圖1 羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Microbial genomic DNA agarose gel electrophoresis of rumen contents in lambs

表2 不同提取方法獲得的羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA濃度(ng/μL)和D值

2.2 重組質粒標準曲線

以已知拷貝數的質粒標準品為模板進行q-PCR反應，10倍為一個稀釋梯度.建立反映Ct值與質粒拷貝數對應關系的定量標準曲線，根據曲線和計算公式可得樣品中各細菌和產甲烷菌的數量.標準曲線見圖3.從圖3中可以看出，微生物重組質粒DAN的的標準曲線的斜率為-0.279 5～-0.347 3，相關系數均大于0.98，符合q-PCR標準曲線的要求.

圖2 q-PCR檢測質粒標準品的熔解曲線Figure 2 Melting curve of plasmid standard substance detected by q-PCR

2.3 羔羊瘤胃內容物微生物拷貝數

對4種方法所獲得的羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA樣品進行了q-PCR檢測，根據q-PCR得到的Ct值及公式計算出4種方法所得DNA樣品中各細菌和產甲烷菌的拷貝數.

由表3可知，4種方法提取到的基因組DNA經q-PCR分析，瘤胃細菌和產甲烷菌的數量存在顯著差異(P<0.001)，其中琥珀酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes)數量最高，總細菌(Total bacteria)次之，白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)數量最少.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的DNA樣品經檢測瘤胃總細菌的數量顯著大于其它方法(P<0.001)、產甲烷菌的豐富度均顯著高于其它方法(P<0.001)，該方法提取效率較高.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法和液氮研磨+CTAB+SDS法所得羔羊瘤胃內容物微生物DNA樣品中琥珀酸擬桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacteramylophilus)、甲烷桿菌(Methanobacteriales)和瘤胃甲烷短桿菌(Methanobrevibacters)的數量近似，且顯著高于另外2種方法(P<0.001).液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法得到的DNA樣品中溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)數量顯著高于其它方法(P<0.001)，液氮研磨+CTAB+SDS法對該菌的提取效率也較高.珠磨+CTAB法獲得的DNA樣品中瘤胃細菌和產甲烷菌的數量顯著低于其他3種方法(P<0.001)，且該方法對于瘤胃產甲烷菌的提取效率較差，總甲烷菌的豐富度僅為5.52 ng/μL，該法所獲得的羔羊瘤胃微生物DNA多樣性較差.液氮研磨+珠磨+CTAB法得到的DNA經q-PCR檢測瘤胃細菌和產甲烷菌數量較珠磨+CTAB法多.

圖3 微生物重組質粒DNA的標準曲線Figure 3 Standard curve of recombinant plasmid DNA of microorganisms

表3 不同DNA提取方法對羔羊瘤胃內容物微生物數量的影響

3 討論

羔羊瘤胃內容物成分復雜，含有龐大的微生物種群、飼料殘渣以及消化道脫落細胞和許多不明生物物質[24]，這使得提取高質量的羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA有一定難度.本試驗中，4種方法提取得到的基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，4條泳道均有DNA譜帶出現，每種方法均加入蛋白酶K，促使微生物細胞破裂而釋放更多的DNA[25]，雖然方法不同，但最終目的都是有效地使微生物細胞壁裂解，去除非核酸成分且避免核酸的損失而得到高質量的基因組DNA[26].液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法條帶有明顯拖尾現象，且泳道下方有亮的核酸短片段，DNA條帶也較液氮研磨+珠磨+SDS +GITC法暗.液氮研磨+珠磨+CTAB法和珠磨+CTAB法均使用了CTAB抽提液，CTAB是一種常用的陽離子洗滌劑，可以沉淀多糖和蛋白質，但是不能有效地裂解細胞[27].研究發現，CTAB更適合于提取真菌基因組DNA[28]，CTAB法主要用于植物性總DNA的提取[29].本試驗中珠磨+CTAB法得到DNA樣品濃度較高但q-PCR檢測結果顯示瘤胃細菌和產甲烷菌的數量顯著低于其它3種方法(P<0.001)，可能是提取到了部分瘤胃真菌和瘤胃內容物中未完全降解的植物纖維的DNA而導致核酸濃度較高.D260/280、D260/230是評價DNA純度的常用指標，Henderson等[11]提出用于分子生物學研究的參考標準，基因組DNAD260/280≈ 1.8，D260/230值在2.0～2.2為宜.結合表1分析，這兩種方法得到的DNA樣品D260/280值均大于1.9(D260/280≈ 1.8，大于1.9表明有RNA污染；小于1.7表明有蛋白質污染)，泳道下部短的核酸片段可能是植物細胞的DNA或者RNA.試驗中液氮研磨+珠磨+CTAB法同時使用了珠磨和液氮研磨兩種物理破壁方法再結合CTAB法提取到的DNA樣品經q-PCR檢測瘤胃細菌和產甲烷菌的數量均高于珠磨+CTAB法(僅用了珠磨)，說明增強前期細胞破壁處理能夠彌補CTAB不能有效裂解微生物細胞壁的缺陷而得到高質量的基因組DNA.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法和液氮研磨+CTAB+SDS法主要采用SDS裂解微生物細胞，SDS是一種陰離子清洗劑，它能夠破壞蛋白質之間的相互作用，溶解細胞膜[30].SDS對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的裂解效果，能夠得到高質量的微生物基因組DNA[31]，提取過程中加入SDS裂解液后70 ℃水浴加強了裂解效果.本試驗中，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法加入了GITC，其使得蛋白變性，提高了DNA的產量，該方法所得DNA樣品濃度為1121.15 ng/μL，D260/280比值為1.94，D260/230比值為1.92，從q-PCR檢測結果(表3)可知，革蘭氏陽性菌溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的數量均顯著大于其它方法，這一結果與曾波[32]等的研究結果一致.但Yu等[33]發現，應用蛋白酶K和GITC提取地表水中鞭毛蟲DNA的產率較低.Myer等[34]利用反復珠磨結合SDS提取的肉牛瘤胃微生物基因組DNA可用于16S rRNA測序分析.本試驗結果表明，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的羔羊瘤胃內容物微生物DNA樣品用于q-PCR檢測表明，革蘭氏陽性菌溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)的數量較高，說明SDS和GITC對羔羊瘤胃細菌和產甲烷菌有良好的作用，能夠有效地裂解細胞使細胞內和細胞壁上的DNA充分釋放出來，該方法所獲得的微生物DNA樣品能夠用于羔羊瘤胃內容物中微生物的多樣性分析.液氮研磨+CTAB+SDS法提取得到的DNA樣品濃度較液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法低，其D260/230比值為1.64，表明所得DNA樣品存在碳水化合物或者化學試劑污染，需要進一步純化.液氮研磨+CTAB+SDS法對于瘤胃細菌和產甲烷菌DNA的提取效果略低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法.

本試驗中，珠磨+CTAB法所得DNA樣品濃度較高，利用q-PCR不能高效地檢測到瘤胃細菌和產甲烷菌數量，液氮研磨+珠磨+CTAB法得到的DNA樣品經q-PCR檢測結果優于珠磨+CTAB法，這可能是因為提取過程中DNA降解嚴重，片段不完整，無法用于分子生物學研究.液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法能夠得到較純的DNA樣品，利用q-PCR技術能夠準確地檢測出瘤胃細菌和產甲烷菌.液氮研磨+CTAB+SDS法所獲得DNA樣品濃度和純度低于液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法，需要進一步純化，液氮研磨+CTAB+SDS法得到的DNA樣品中瘤胃細菌和產甲烷菌數量與液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法相近.由此得出，SDS較CTAB更適合于提取羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA.綜上所述，液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法提取的羔羊瘤胃微生物基因組DNA濃度和純度較高，且q-PCR檢測出瘤胃細菌和產甲烷菌的數量最多，能夠提供質量較高的羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA用于分子生物學研究.

4 結論

本研究采用液氮研磨+珠磨+SDS+GITC法所獲得的羔羊瘤胃內容物微生物基因組DNA質量較高，可用于研究羔羊瘤胃內容物中微生物的定植.為全面了解羔羊瘤胃健康發育奠定基礎.