置豐富環(huán)境中飼養(yǎng)的三叉神經(jīng)病理痛小鼠行為學(xué)、腦組織終板床核活動度觀察

劉婷婷，孫曉羽

1 遼寧省人民醫(yī)院，遼寧沈陽110000；2 腦科學(xué)研究院神經(jīng)生物教研室

三叉神經(jīng)病理痛是臨床最常見的慢性痛［1］，病程較長，約50%的三叉神經(jīng)病理痛患者并發(fā)焦慮、抑郁等精神疾患［2］。因此，臨床工作者更應(yīng)關(guān)注三叉神經(jīng)病理痛誘發(fā)的負性情緒。終紋床核又叫擴展杏仁核，位于基底前腦［3］。有研究表明，激活終紋床核可引起焦慮行為［4］。更有研究發(fā)現(xiàn)，終紋床核調(diào)控甲醛誘發(fā)的痛厭惡情緒［5］。終紋床核是否參與神經(jīng)病理痛仍不清楚。既往研究證實，豐富環(huán)境可影響海馬神經(jīng)元突觸和細胞的生物活性，從而改善疼痛和抑郁行為［6-7］，但對終紋床核的影響尚不可知。眶下神經(jīng)卡壓術(shù)為三叉神經(jīng)病理痛動物模型建立的常用方法［8-9］。2018年12月—2019年4月，我們采用眶下神經(jīng)卡壓術(shù)建立三叉神經(jīng)病理痛小鼠模型，觀察豐富環(huán)境對三叉神經(jīng)病理痛小鼠行為的改善作用及終紋床核的影響，從而為“豐富環(huán)境理念”向臨床轉(zhuǎn)化提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 野生型C57BL/6J 小鼠8 周（購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心），體質(zhì)量約25 g?？笷osB 抗體（（abcam，ab11959，1：1000）），Alexa Fluor488 二抗（（Invitroge A-21202，1：200），正常驢血清（Sigma-Aldrich，D9663）。von-Frey fila?ments（Stoelting），恒溫箱冰凍切片機（Leica），動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（Noldus），激光共聚焦掃描顯微鏡（Olympus）。

1.2 小鼠分組、三叉神經(jīng)病理痛小鼠模型的建立及在豐富環(huán)境中飼養(yǎng) 將23 只野生型C57BL/6J 小鼠隨機分3 組：豐富環(huán)境組（n=8）、標準環(huán)境組（n=9）、sham 組（n=6），所有實驗動物飼養(yǎng)溫濕度可控的條件下，同時保證12 h光照、充足的飲食。該實驗通過復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準（批號：SYXK 2009-0082）。豐富環(huán)境組、標準環(huán)境組均采用眶下神經(jīng)卡壓術(shù)建立三叉神經(jīng)病理痛小鼠模型：小鼠按照50 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉動物，待動物深反射消失，用碘伏消毒動物左側(cè)面頰的皮膚，暴露口腔，平左側(cè)第一磨牙旁黏膜處，鈍性分離口腔黏膜，用玻璃鉤針暴露眶下神經(jīng)，將5-0 羊腸線從神經(jīng)下方穿出，撤走分離鉤針后打結(jié)，使打好的結(jié)搭在神經(jīng)上，還納神經(jīng)至原位。用組織膠封閉創(chuàng)面，把小動物放置在小太陽處，待蘇醒后放回動物房。術(shù)后豐富環(huán)境組小鼠采用豐富環(huán)境箱［豐富環(huán)境箱的體積為100 cm×50 cm×75 cm（長×寬×高），籠內(nèi)有兩個滾輪，一個長隧道，各種顏色的木質(zhì)玩具，每2～3天更換玩具以保持新奇感］飼養(yǎng)，每籠5 只，飼養(yǎng)35 d；標準環(huán)境組小鼠采用標準環(huán)境箱（為正常小鼠籠，體積為29 cm×17.8 cm×16 cm，箱內(nèi)僅給小鼠提供飼料和水）飼養(yǎng)，每籠5 只，飼養(yǎng)35 d；Sham 組僅鈍性分離口腔黏膜，然后采用標準培養(yǎng)箱飼養(yǎng)35 d。

1.3 各組行為學(xué)測試 小鼠眶下神經(jīng)卡壓造模第35 d 行動物行為測試。①機械痛敏閾值：采用vonfrey 測試。實驗前3 d，每只小鼠在實驗員手中適應(yīng)30 min，同時用von Frey測試棒靠近面部但不進行測試。正式測試時，保持周圍環(huán)境安靜，待小鼠在實驗員手中溫順后再進行測試。選取0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6 g 的von Frey 纖毛，按照從小到大的方式作用于手術(shù)同側(cè)觸須墊的皮膚上。當纖毛彎曲至90o，停留2 s，動物出現(xiàn)快速而明顯的撤退反應(yīng)作為陽性指標。不同度量值的纖毛測試5次，出現(xiàn)3次陽性反應(yīng)時，所對應(yīng)的纖毛克數(shù)即作為機械痛敏的閾值，閾值越低，痛敏越嚴重。②焦慮水平測試：分別采用礦場行為測試（OF）及高架十字迷宮（EPM）。所有的情緒相關(guān)行為測試前，動物需要預(yù)先適應(yīng)環(huán)境至少30 min。維持室內(nèi)溫度在24 ℃并有良好的通風(fēng)。在一個正方形的測試箱（40 cm×40 cm×30 cm，長×寬×高）中，把該區(qū)域平均分成16 個正方形，中間4 個正方形稱中心區(qū)域。測試時，實驗者手托小鼠并溫柔地把動物放在曠場的中心區(qū)域，通過視頻跟蹤系統(tǒng)（Ethovision XT v11.5，Noldus BV）記錄動物5 min 內(nèi)的運動情況。以動物在曠場中心區(qū)域停留時間作為反映焦慮水平的指標，停留時間越短，動物越焦慮。高架十字迷宮由四個相互垂直的臂（6 cm×35 cm）和中央平臺區(qū)（6 cm×6 cm）組成，距離地面50 cm，其中閉合臂高20 cm。測試時，實驗者手托小鼠并溫柔地把動物放在面朝開臂的中央平臺的位置。通過視頻跟蹤系統(tǒng)（Ethovision XT v11.5，NoldusBV）記錄動物在5 min 內(nèi)的運動軌跡。以動物在開臂停留的時間和進入開臂的次數(shù)作為反映焦慮水平的指標，開臂中停留時間越短、進入次數(shù)越少，代表動物越焦慮。③抑郁水平測試：懸尾實驗（TS）裝置是一個正方形的塑料箱（30 cm×30 cm×30 cm，長×寬×高）。在箱體頂部中央的位置固定一個鋁制吊桿。測試時，在距離動物尾巴末端1 cm 的位置粘貼醫(yī)用膠布，測試時將動物懸掛在鋁制吊桿上，保證動物鼻尖距離箱體底部2～3 cm。利用攝像機記錄6 min 動物在懸尾箱的活動情況。測試結(jié)束后溫柔地把動物從吊桿上取下。分析視頻后4 min內(nèi)的不動時間，不動時間越長，動物越抑郁。

1.4 各組腦組織終板床核中delta FosB陽性細胞計數(shù) 行為測試后，4%甲醛灌注取腦組織，蔗糖梯度脫水后，OCT 包埋，-80 ℃的冰箱速凍。組織復(fù)溫切片，厚度35 μm。將收集到的腦組織放在24 孔板內(nèi)，PBS 溶液沖洗3 次（10 min/次），10%正常驢血清和0.3% Triton X-100 的0.01 mol/L PBS 溶液室溫封閉2 h。anti-FosB 抗體（abcam，ab11959，1∶1 000），4 ℃過夜。次日，PBS 溶液沖洗3 次，然后孵育Alexa Fluor 488（Invitroge A-21202，1∶200），4 ℃2 h，PBS溶液洗3 次。封片，激光共聚焦熒光顯微鏡（FV1000，Olympus）進行圖像采集和處理，手動計數(shù)×20倍視野下delta FosB細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad6.01 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組行為學(xué)改善情況 豐富環(huán)境組、標準環(huán)境組、Sham 組小鼠機械痛敏閾值分別為（0.1038 ±0.01647）、（0.0133 3 ± 0.002 2）、（0.286 7 ±0.0510 3）g，與Sham 組比較，標準環(huán)境組機械痛敏閾值降低（P<0.0002）；與標準環(huán)境組小鼠比較，豐富環(huán)境組小鼠機械痛敏閾值升高（P<0.05）。

在OF測試中，與Sham 組相比，標準環(huán)境組小鼠中心停留時間縮短（P<0.0001），其中兩組總距離比較，P>0.05；與標準環(huán)境組比較，豐富環(huán)境組中心停留時間延長（P<0.01）。EPM 測試中，與sham 組相比，標準環(huán)境組總距離縮短，開臂停留時間、開臂穿越次數(shù)減少，表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為（P<0.01）。豐富環(huán)境組在OF、EPM 測試中無焦慮樣表現(xiàn)（P>0.05）；在TS 測試中，標準環(huán)境組較Sham 組的不動時間延長，出現(xiàn)行為絕望樣的抑郁表現(xiàn)（P<0.0001）；與標準環(huán)境組比較，豐富環(huán)境組不動時間縮短，絕望行為略有改善（P<0.05）（見表1）。

表1 3組小鼠焦慮、抑郁情況

表1 3組小鼠焦慮、抑郁情況

組別豐富環(huán)境組標準環(huán)境組Sham組n 8 9 6 OF總距離（cm）1 565±112.1 1 437±170.4 1 815±210.5 OF 中心停留時間（s）25.62±2.82 7.59±2.07 30.23±3.80 EPM總距離（cm）1 394±122.8 1 146±124.8 1 724±184.5 EPM 開臂停留時間（s）35.38± 2.98 16.85± 4.65 53.58±13.55 EPM 穿越次數(shù)（次）2.5±0.76 2.0±0.55 5.0±1.00 TS（s）120.9± 8.60 164.3± 8.95 87.3±10.12

2.2 三組腦組織終紋床核中delta FosB 陽性細胞數(shù) 豐富環(huán)境組、標準環(huán)境組、Sham 組終紋床核處delta FosB 陽 性 細 胞數(shù) 分 別 為（81.20 ± 3.26）、（310.90 ± 8.98）、（71.30 ± 2.36）個/HP，與Sham 組相比，標準環(huán)境組終紋床核處delta FosB陽性細胞數(shù)增加（P<0.01）；與標準環(huán)境組比較，豐富環(huán)境組終紋床核處delta FosB陽性細胞數(shù)減少（P<0.05）。

3 討論

三叉神經(jīng)痛主要表現(xiàn)為三叉神經(jīng)分布區(qū)突發(fā)短暫的電擊樣疼痛，三叉神經(jīng)痛作為臨床上常見的慢性疼痛，常合并焦慮抑郁樣癥狀，與此同時，焦慮抑郁等心理疾患反過來又加重病痛［8-10］。三叉神經(jīng)痛發(fā)病機制包括神經(jīng)根受壓或牽拉、腦干功能紊亂、基底節(jié)或皮層痛覺調(diào)節(jié)異常，但最廣為接受的是神經(jīng)血管學(xué)說。本實驗通過眶下神經(jīng)卡壓術(shù)模擬三叉神經(jīng)痛，35 d后引起標準環(huán)境組小鼠von-frey機械痛閾值降低，OF中心區(qū)停留時間縮短，EPM總距離降低，開臂停留時間縮短，開臂穿越次數(shù)減少，出現(xiàn)焦慮樣表現(xiàn)。TS 測試中不動時間延長，表現(xiàn)出抑郁樣行為。以上實驗結(jié)果表明神經(jīng)卡壓術(shù)后引起小鼠痛敏化、焦慮抑郁的發(fā)生。通過35 d的豐富環(huán)境干預(yù)，豐富環(huán)境組小鼠痛敏、焦慮抑郁樣癥狀減輕。我們推測，豐富環(huán)境的干預(yù)可能改善了三叉神經(jīng)痛小鼠皮質(zhì)、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的功能。

大量研究表明，終紋床核是邊緣皮質(zhì)重要組成部分，直接影響下丘腦—垂體—腎上腺軸，參與恐懼、焦慮、應(yīng)激等精神行為活動［11-12］。我們通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，眶下神經(jīng)卡壓引起標準環(huán)境組終紋床核delta FosB 細胞數(shù)的表達增加，再次驗證終紋床核在慢性應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用［13-16］。豐富環(huán)境組小鼠在豐富環(huán)境干預(yù)后，終紋床核delta FosB的細胞數(shù)表達減少，終紋床核活躍性降低。由此推測，終紋床核參與神經(jīng)病理痛的發(fā)病過程，豐富環(huán)境通過影響終紋床核的功能從而改善慢性痛及相關(guān)的負性情緒。

豐富環(huán)境在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的積極作用得到廣泛證實［17］。豐富環(huán)境可增加動物的社交和探險行為，提高海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、環(huán)腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、基質(zhì)細胞源性因子-1，改善海馬炎癥反應(yīng)和神經(jīng)再生［18-20］。暴露于豐富環(huán)境的大鼠可降低扣帶皮層、海馬、下丘腦前部和背內(nèi)側(cè)、中縫背核的delta FosB 蛋白免疫活性。終紋床核又視為海馬、室旁核精神環(huán)路的中心，我們同樣發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境減少了終紋床核delta FosB 的表達，緩解了眶下神經(jīng)卡壓引起的痛敏和負性情緒，提示豐富環(huán)境可能是通過抑制終紋床核改善眶下神經(jīng)卡壓引起的痛敏，焦慮抑郁樣癥狀。

綜上所述，置于豐富環(huán)境中的三叉神經(jīng)病理痛小鼠慢性痛敏化和焦慮抑郁行為改善，終紋床核活躍度降低。疼痛是感覺和精神兩個維度構(gòu)成的共存?。?1-22］。終紋床核在神經(jīng)病理痛方面的研究相對局限，終紋床核不同的細胞亞群，投射在調(diào)控三叉神經(jīng)病理痛中發(fā)揮怎樣的作用仍不清楚，需進一步探討。