自擬出血性中風1 號方治療腦出血作用靶點的篩選及其生物學功能分析

吳倩，王曉玲，唐勇，張潔

1 陜西中醫藥大學，陜西咸陽712046；2 安康市中醫醫院

腦出血（ICH）為非外傷性腦實質內血管破裂出血，是一種潛在的破壞性神經損傷，腦出血患者占住院卒中患者的比例國內為18.8%～47.6%［1］，歐美為10%～15%［2］，具有致死率高、致殘率高的特點。ICH 的病理機制包括機械性損害導致的原發性損傷與血腫代謝產物的毒性反應、免疫損傷、氧化應激、炎癥反應、神經細胞凋亡等引起的繼發性損害［3］。

ICH 隸屬于中醫“中風”范疇，《黃帝內經》將其描述為“大怒則行氣厥，而血菀于上，使人薄厥”。現代醫家認為其病機為“臟腑功能失調，氣血陰陽失衡導致氣血逆亂，上沖于腦”。王平平等［4］研究發現在疾病急性期以風證、火證、痰證等標實證候為主。研究表明，中藥可以通過調控體內炎癥、氧化、凋亡、抑制血管痙攣和自噬等相關通路來減少血腦屏障破壞及腦組織水腫、抑制神經細胞凋亡、改善神經功能障礙，且這些中藥的有效成分大多來源于清熱藥、理血藥等［5］。出血性中風1 號方為王曉玲主任醫師多年臨床經驗方，主要由5味藥物組成，方用水牛角清熱涼血以寧血止血，鉤藤平肝熄風、生大黃清熱涼血止血，牛膝引火下行、梔子清熱瀉火，佐助水牛角清熱涼血，佐助鉤藤熄風降火，五藥共奏平肝熄風、涼血止血之功效。在臨床應用中療效明顯，能夠促進患者神志轉清、減輕神經功能缺損，且未發現有使血腫繼續擴大及明顯不良反應的發生［6-7］。現為進一步擴大臨床應用，預測其可能作用機制，2020 年3 月-2020 年7 月，我們采用網絡藥理學及分子對接技術對出血性中風1 號方治療ICH 的作用靶點、生物功能、信號通路進行分析，預測其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 數據來源 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），TCMID數據庫及化學專業數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/），OMIM 數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，http：//omim.org/）、DisGenet 數據庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）及GeneCards 數據庫，String 數據庫（https：//string-db.org/），metascape 數據庫（http：//metascape.org），PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及RCSB PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）。

1.2 出血性中風1 號方化學成分及其作用靶點篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集鉤藤、牛膝、大黃、梔子4 味中藥的化學成分，并根據口服利用度（OB≥30%）、生物類藥性（DL≥0.18）、血腦屏障（BBB≥-0.3）篩選出主要化學成分及其作用靶點。通過TCMID 數據庫及化學專業數據庫［8］篩選出水牛角化學成分，對去重后的成分進行ADME（Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion，毒藥物動力學）篩選后獲取主要成分及作用靶點。將獲取的靶點名稱在UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）中轉換為對應的基因名。將最終得到的靶點信息進行整合，利用Cytoscape 3.7.2 軟件以5 味藥篩選后的化學成分與標準化的基因名稱為基礎，形狀大小按照Degree 值設定，并將成分按照值大小依次排列繪制相關藥物靶點網絡圖。

1.3 ICH 相關靶點、出血性中風1 號方作用靶點及其共同的靶點獲取 借助OMIM 數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，http：//omim.org/）、Dis?Genet 數據庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeN?ET/menu/home）及GeneCards 數據庫，以“Cerebral hemorrhage”為檢索詞收集有關ICH 的疾病靶點。因GeneCards 數據庫中靶點信息過多，根據經驗，選擇Score值大于中位數的值進行篩選，將三個數據庫所得到的疾病靶點去重后的靶點與藥物靶點通過R軟件繪制韋恩圖，獲得自擬方治療ICH 的潛在作用靶點，并繪制疾病—成分—靶點網絡圖。

1.4 出血性中風1 號方與ICH 共同靶點的蛋白互作網絡（PPI）構建 將所獲得的出血性中風1 號方與ICH 共同靶點輸入String 數據庫（https：//stringdb.org/），選擇Multiple Protein，物種限定為homo sa?piens，將最低相互作用評分設置為高置信度（0.900）并隱藏游離節點，其余值保持默認設置，獲得藥物—疾病的PPI圖，并導出TSV文件。

1.5 出血性中風1 號方與ICH 共同靶點的生物學功能分析 將出血性中風1 號方與ICH 共同靶點導入metascape（http：//metascape.org）數據庫，設置P<0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路，并將結果進行保存。將保存的數據信息通過R軟件進行可視化分析。

1.6 出血性中風1 號方核心化學成分與靶點蛋白的分子對接 將篩選出的出血性中風1 號方核心化學成分通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載2D 結構的SDF 文件，通過Chem?Bio 3D 將其轉換為mol2 格式的文件，并通過RCSB PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載pdb 格式的需要對接的靶點蛋白。蛋白篩選遵循：人源蛋白優先；分辨率越高越好；含配體結構且配體結構與所對接成分相似度高的優先。利用PyMol 軟件將靶點蛋白去除水分子后與原始配體進行分離后保存。最后將靶點蛋白、配體與核心化學成分導入到Autodock Vina［9］軟件 中 轉換為pdbqt 格 式 后進行分子 對 接。將PPI 結果中前7 個靶點基因及靶點—通路中排名前3 的基因與排名前10 的化學成分通過Autodock Vina 軟件進行半柔性分子對接［10］，通過結合能（Af?finity）值來判斷二者結合好壞，結合能小于0說明配體與受體可以自發結合，且值越小表示結合能越高，活性成分越容易與受體結合［11］。

2 結果

2.1 中風1 號方化學成分與相關作用靶點 初步獲取方中五味藥的化學成分有86 種，經過ADME篩選并刪除無靶點的成分后得到53 種（包括大黃4種、鉤藤27 種、牛膝14 種、梔子8 種、水牛角1 種），其中大黃、鉤藤、牛膝、梔子重復成分為β-谷甾醇（beta-sitosterol），牛膝、梔子重復成分為豆甾醇（Stigmasterol），對應有效靶點865 個，去重后保留124 個單一靶點。

藥物—成分—靶點關系網絡圖見圖1，其中β-谷甾醇為大黃、鉤藤、牛膝、梔子共同成分；豆甾醇為牛膝、梔子共同成分。該圖中共有178個節點（包括藥物5 個，成分49 個，靶點124 個），1 776 條邊。De?gree 值排名前10 位的成分分別是β-谷甾醇（140）、豆甾醇（58）、漢黃芩素（42）、黃芩素（34）、育亨賓（33）、methyl（E）-2-［（2S，3Z，12bS）-3-ethylidene-2，4，6，7，12，12b-hexahydro-1H-indolo［3，2-h］quinoli?zin-2-yl］-3-methoxyprop-2-enoate（30）、（E）-16，17-Didehydro-17-methoxy-17，18-seco-3-beta-yohimban-16-carboxylic acid methyl ester（28）、δ（sup 18）-毛鉤藤堿（28）、四氫鴨腳木堿（25）與coryincine（25）；靶點排名前10 的分別是PTGS2（45）、PTGS1（36）、SCN5A（35）、AR（31）、KCNH2（29）、CHRM1（28）、CHRM3 （26） 、F10 （26） 、ADRA1B （24） 與NCOA2（21）。

圖1 “藥物—成分—靶點”網絡圖

2.2 ICH 與出血性中風1 號方化學成分共同靶點三個疾病數據庫靶點進行整合去重后得到ICH相關靶點1 896 個。出血性中風1 號-ICH 共同靶點71個。“疾病—成分—靶點”網絡圖見圖2，共包括126個節點，838 條邊，Degree 值排名前5 的靶點分別是PTGS2（41）、PTGS1（32）、AR（31）、F10（26）與ACHE（18），化學成分排名前5 的分別是漢黃芩素（29）、黃芩素（22）、β-谷甾醇（22）、育亨賓（17）與methyl（E）-2-［（2S，3Z，12bS）-3-ethylidene-2，4，6，7，12，12bhexahydro-1H-indolo［3，2-h］quinolizin-2-yl］-3-me?thoxyprop-2-enoate（16）。

2.3 出血性中風1 號方治療腦出血潛在作用靶點PPI 圖 通過String 數據庫最終得到71 個出血性中風1 號方治療ICH 的潛在作用靶點的PPI 圖（圖3），其中包括71 個節點，183 條邊，平均度值為5.3。JUN、TP53、AKT1、VEGFA 等基因出現頻次最高，推測這些靶點可能為出血性中風1 號方治療ICH 的潛在作用靶點。

圖2 “疾病—成分—靶點”網絡圖

圖3 出血性中風1號方治療腦出血潛在靶點的PPI圖

2.4 出血性中風1 號方治療腦出血靶點的生物學功能分析結果 最終得到1 715 條生物功能富集結果，其中1547 條結果富集在生物過程（BP）中、50 條結果富集在細胞成分（CC）中、118 條結果富集在分子功能（MF）中，以P<0.01 篩選前20 條，得到20 條BP結果，8條CC結果，20條MF結果，BP結果主要集中在毒性作用、氧化應激反應、生長調控、對脂多糖的反應、凋亡、對氧水平的反應等；CC主要集中在膜筏、谷氨酸能突觸、線粒體外膜、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物等方面；MF 主要集中在蛋白激酶活性、銨離子結合、細胞因子受體結合、蛋白酶結合、核受體活性等方面；富集到KEGG 通路上的結果有130條，根據P<0.01 篩選前20 條結果，與腦出血相關通路主要涉及到PI3K-AKT 信號通路、P53 信號通路、cAMP 信號通路、NF-κB 信號通路、炎癥介質對TRP通路的調節等。

2.5 出血性中風1 號方核心化學成分與靶點分子對接結果 FOS 與VEGFA 的PDB 結構未找到含有效配體的蛋白結構，故未進行分析。出血性中風1 號方核心化學成分與靶點蛋白分子對接結果見表1。出血性中風1 號方的主要化學成分與核心靶點對接均小于-5 kcal/mol，結合圖4 可知，AK?TI 與各成分對接結果較好，且與MOL000358 結合性最強。

圖4 出血性中風1號方核心化學成分與靶點蛋白分子對接熱力圖

表1 出血性中風1號方核心化學成分與靶點分子對接結果（kcal/mol）

3 討論

ICH 的發病機制尚不完善，目前關于其病理機制主要包括了早期血腫擴大對腦組織造成的原發性損傷，以及組織水腫、毒性物質釋放、氧化應激、細胞凋亡等引起的繼發性損傷［12］。目前對ICH的治療也集中在降低原發性損傷，改善腦組織的繼發性損傷上。出血性中風1號方各單味藥物在臨床應用與動物實驗中療效顯著。研究表明水牛角可以通過縮短大鼠凝血酶原時間以及升高血小板數目來產生止血作用［13］；大黃能夠促進腦出血患者神經康復，降低病理性損傷，抑制細胞凋亡，減輕腦組織水腫［14］；梔子具有減輕血腦屏障通透性［15］，抑制水通道蛋白4 及基質金屬蛋白酶9 的表達［16］、增強抗氧化能力［17］、抑制NF-κB 活化減少炎癥因子釋放［18］來減輕腦水腫，干預炎癥反應，抑制神經細胞凋亡［19］的作用；鉤藤能保護內皮細胞［20］，抗氧化、調節中樞神經及其受體、抑制炎癥因子及其相關通路、抑制神經細胞凋亡、降低鈣超載保護神經細胞［21］；牛膝可降低大鼠血壓，保護神經元，改善卒中后神經癥狀［22］。通過這些單藥所發揮的作用表現出中藥治療疾病的復雜性，為復方治療ICH 的藥理作用提供依據，從側面印證了其對ICH的治療價值。

網絡藥理學通過多層次、多靶標、多途徑地對中藥及其復方作用于人體的可能作用機理進行預測［23］，目前已廣泛應用于藥物作用機制研究、新藥研發等方面，為中藥發展提供了可靠的數據支撐［24-25］。分子對接［26］是基于配體與受體的鎖鑰原理，研究小分子配體與受體生物大分子的相互作用，尋找藥物有效成分，以便從分子水平研究藥物作用機制。

本研究通過應用網絡藥理學從新的角度對出血性中風1號方治療腦出血的的可能作用機制進行分析，在疾病—藥物—靶點網絡圖中β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩苷等五種化合物靶點豐富，推測這些藥物可能在治療ICH 中起到了重要作用，也表明了中藥治療疾病作用機制的復雜性。其中β-谷甾醇經研究發現能夠緩解炎癥［27］與氧化應激反應［28］；黃芩素能夠抑制神經細胞凋亡［29］，維持血腦屏障的完整性［30］，并緩解氧化應激與炎癥反應［31］；漢黃芩素能夠調節氧化應激與炎癥反應［32］；這三種有效成分作用機制主要集中在減輕氧化應激與炎癥反應，抑制神經細胞凋亡等方面。其余2種化學成分尚未發現有明確抑制ICH損傷的作用機制，PPI互作網絡所獲得的關鍵靶點作用也集中在抑制炎癥反應、促進神經保護、抑制細胞凋亡等。這些成分與靶點的分子對接結果也顯示二者間結合能力較好，推測出復方的主要化學成分可能與這些關鍵靶點結合，通過減輕炎癥反應與氧化應激、抑制細胞凋亡等ICH 后的繼發性損傷，從而起到腦保護的作用。

GO 分析發現出血性中風1 號方對腦出血的治療可能集中在毒性作用、氧化應激、凋亡等生物過程中；KEGG 富集通路包括了PI3K-AKt 信號通路、P53信號通路、NF-κB 信號通路等；其中的PI3K-AKt 信號通路在細胞增殖、分化、凋亡中發揮重要作用，ICH發生后激活PI3K與下游的Akt結合，使得Akt磷酸化，激活下游凋亡靶點引起細胞凋亡［33］。NF-κB作為PI3-AKT 通路的下游蛋白，在炎癥反應中發揮著重要的作用，是ICH繼發性損傷的重要因子，可刺激TNF-α 與IL-1β 活化，而這些因子反過來再次激活NF-κB，使炎癥反應放大［34］，加重腦組織損傷。根據以上研究，猜測出血性中風1 號方中的藥物有效成分可能作用于TNF、IL-6 等炎癥因子，降低胞質中的IKB 蛋白降解，抑制NF-κB磷酸化表達，使其不能進入核內參與炎癥反應，抑制其上游通路PI3-AKT激活，減緩炎癥反應的發生，從而控制腦出血繼發性損傷的發生。采用分子對接驗證后發現，藥物中的核心化學成分與靶點結合能力較好，這些靶點作用集中在炎癥反應與細胞凋亡等方面。提示出血性中風1號方對腦出血的治療可能集中在抑制炎癥反應與細胞凋亡等方面。

綜上所述，通過運用網絡藥理學方法可以得出，出血性中風1 號方可能是通過多靶點、多通路減少炎癥反應、抑制細胞凋亡來降低ICH 后的繼發性損傷，從而達到臨床治療的目的。本次研究主要闡述了中藥復方復雜性，為后期臨床應用提供了數據支持，但因網絡藥理學所采用的數據庫信息有不一樣的實驗條件，導致假陽性結果發生，并且已經評價過的成分與靶點信息及所檢索的數據庫數量有限，數據完整性與準確性有待提高，不能完全揭示其藥理作用，具有一定的局限性［35-36］，因此預測的分子機制仍需通過后期動物與細胞實驗進一步探索及驗證。